СИНТЕЗ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ 5-ФТОР-2-ДЕЗОКСИРИБОЦИТИДИН

Читать онлайн: 
Текст статьи: 

БИООР ГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Том 18 * № 5 * 1Э92
УДК 547.963.32.057:542.95
1992 г. Е . А . Ь'убаре ва, Е . А . Рома н о в а , Т . С. Ор е ц к а я ,
Е .С . Г р омо в а , 3. А . Ша б а р о в а
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, химический
факультет
Предметом настоящего исследования явилась разработка синтеза оли-
годезоксирибонуклеотидов, имеющих в своем составе 5-фтор-2'-дезокси-
рибоцитидин (iPCyd), Такие олигонуклеотиды перспективны для изучения
механизма действия цитозиновых ДНК-метилаз [1, 2].
Известна работа [3], в которой fPCyd был включен в синтетический
ДНК-дуплекс, содержащий участок узнавания ДНК-метилазы Hhal.
В этом случае был осуществлен ферментативный синтез poly(fl5CG).
Причиной отказа от химического подхода при синтезе олигонуклеотидов
с данной модификацией явилась нестабильность б.'-О-диметокситритил-
№-бензоил-5-фтор-2'-дезоксицитидина при кислотной обработке (5% ди-
хлоруксусная кислота в хлористом метилене), используемой обычно для
удаления диметокснтритяльной защитной группы на каждой стадии наращивания
олигомерной цепи [3]. Включение сильного электроноакцепторного
заместителя — атома фтора -- в цитозиновое основание изменило
химические свойства нуклеозида.
Нами изучена устойчивость 5'-0,1Ч-защищенного fPCyd в условиях
стандартных постсинтетических обработок олигонуклеотидов. Показано,
что при выдерживании 5'-0-диметокситритил-М4-бензоил-5-фтор-2'-дезо-
ксицитидина в концентрированном аммиаке при 55° С в течение 18 ч и
при последующем действии 80% водного раствора уксусной кислоты при
20° С в течение 40 мин происходит удаление защитных групп без изменения
структуры фторированного нуклеозида. Вероятно, отсутствие бензоильной
защиты по аминогруппе [ (MeO)2TrJfl5Cyd делает нуклеозид
более устойчивым при последующей кислотной обработке. Учитывая эти
результаты, мы осуществили введение flr’Cyd на 5'-конец олигонуклеотидов
в ходе их химического синтеза с сохраненной концевой диметокситри-
тильной группой. При этом модифицированный олигонуклеотид подвергается
кислотной обработке лишь после удаления щелочелабильных
защитных групп и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Олигонуклеотиды, содержащие
fl'Cyd внутри олигомерной цени, получали лигированием на комплементарной
матрице двух олигонуклеотидов нужной длины и состава,
один из которых содержит 5'-концевой fPCyd (схема).
( 5 1- 3 1) ACGGATC p f 1 5CAGGAGTGAC ■ ______ ACGGATCfl5 CAGGAGTGAC
( 3 ' — 5 1 ) GCCTAG----------- GTCCTCAC GCCTAG-----GTCCTCAC
( 5 1- 3 1) ACGGATCCA---G-----GAGTGAC _____ACGGATCCA---GGAGTGAC
( 3 1- 5 1 ) GCCTAGGTf1 Cp CTCAC GCCTAGGTf15 CCTCAC
Префикс «<Ь (дсзокси) при обозначении дезокснрибонуклеоаидо» и олигодезокси-
рибоиуклеотидов опущен; fPCyd - 5-фтор 2'-дезоксирибош5ткдпн,
748
Исходным соединением для синтеза fl*Cyd явился 2'-дезоксиуридия»
3',5.'-ди-0-адетильное производное которого было обработано элементарным
фтором [4]. Эта работа проводилась в лаборатории проф. Д. Цеха
совместно с д-ром К,-Д. Пайном (Берлин, Гумбольдтский университет).
Далее по методике [5] из 3',5'-ди-0-ацетел-5-фтордезоксиуридива получали
5-фтордезоксицитидин.
Бензошшрование экзоциклической аминогруппы fPCyd хлористым
бензоилом с промежуточным силилированием гидроксилов по методике
Ти [6] оказалось малоэффективным. Ацилированный нуклеозид хорошо
растворим в эфире, что затрудняет его отделение от бензойной кислоты,
которую обычно экстрагируют из реакционной смеси эфиром. Присутствие
же бензойной кислоты в смеси вызывает деструкцию нуклеозида.
Нами был изменен порядок введения защитных групп: первоначальное
5'-О-тритшгарование fl5Cyd по стандартной методике [6] с последующим
ацилированием аминогруппы бензойным ангидридом в спирте [7]. По
окончании реакции 5'-0-диметокситритил-№-бензоил 5-фтордезоксицитидин
экстрагировали хлороформом, при этом значительная часть бензойной
кислоты в виде тгриэтиламмониевой соли оставалась в водной фазе.
Полученный по методике [8] З' МД-диизопропиламидометилфосфит
5' -О, N -защищенного 5-фтордезоксицитидина без дополнительной очистки
был введен в олигонуклеотидный синтез по стандартному регламенту
получения олигодезоксирибонуклеотидов на автомате-синтезаторе Applied
Biosystems 380В. В результате были синтезированы два олигонуклеотида:
(5')i(MeO),Tr]frCAGGAGTGAC (la) и (5 ) ( (МеО)гТг)П5~
CTGGATCCG (Па). В тех же условиях были получены все ^модифицированные
олигодезоксирибонуклеотиды, используемые далее для ферментативного
лигирования (схема).
Олигонуклеотиды выделяли методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, используя
гидрофобные свойства 5'-0-диметокситритильной группы [9],
и затем детритилировали. Нуклеозидный состав соединений 1Т-
CAGGAGTGAC (1) и fPCTGGATCCG (II) доказывали исчерпывающим
гидролизом смесью фосфодизстеразы змеиного яда и фосфомоноэстеразы
в течение 3 ч при 37° С с последующим анализом гидролизата ВЭЖХ и
сравнением с контрольной смесью нуклеозидов [10].
С помощью Т4~полинуклеотидкиназы проведено 5' фосфорилирование
и 5'-32Р-мечение олигонуклеотидов (I) и (II) и не обнаружено изменения
эффективности работы фермента.
Соединения ACGGATCfPCAGGAGTGAC (HI) и CACTCiTCTGGATCCG
(IV), содержащие fFCyd внутри цени, получали ферментативным лиги-
рованием с помощью Т4-ДНК-лигазы из соответствующих олигонуклеотидов
на комплементарной матрице (схема) в стандартных условиях [10],
Первичную структуру синтезированных олигонуклеотидов (III) и'(IV)
и исходных соединений (I) и (II) подтверждала методом химической
деградации нуклеиновых оснований [И ] . Влияние сильного электроноакцепторного
заместителя в fl'Cyd проявляется в реакции с перманганатом
калия.
Таким образом, нами показано, что олигонуклеотиды, содержащие
fl5Cyd в середине цепи, достаточно просто и эффективно получаются комбинацией
химического и ферментативного синтеза. Таким путем можно
получать олигонуклеотиды не только с единичным включением остатка
fPCyd, но и с несколькими остатками fl5Cyd, отстоящими друг от друга
на 8—7 нуклеотидных звеньев, если проводить лигирование нескольких
олигонуклеотидов с 5'-концевыми fPCyd.
Авторы выражают благодарность В. Н. Сергееву, В. Н. Ташлицкому
и Г. Я. Шефлян за помощь при выделении и анализе олигонуклеотидов.
74 9
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Santi D. V., Garrett C. E., Barr P. J. //Cell. 1983. V. 33. № 1, P. 9— 10.
2. Santi U. V., Wataya Y., Matsuda A. // Enzyme-activated Irreversible Inhibitors / Eds
Seiler N., Jung M. J., Koch-Weser .T. Amsterdam — N e w York — Oxford: Elsevier —
North-Holland Biomedical Press, 1978. P. 291-303.
3. Osterman D. G., DePillis G. D., Wu J. C., Matsuda A,, Santi D. V, // Biochemistry.
1988. V. 27. № 14. P. 5204-5210.
4. Cech D., Meinert H., Etzolt G., Langen P. //J. Prakt. Chem. 1973. B. 315. S. 149-153.
5. Krug A., Schmidt S., Lekschas Lemke K., Cech D. 1/3. Prakt. Chem. 1989. B. 331.
S. 835-842.
6. Jones Я. A.. // Oligonucleotide Synthesis: a Practical Approach /Ed. Gait M. J. Oxford,
Washington DC: IRL Press, 1984. P. 23, 24.
7. Schalter H., Weimann G., Lerch В., Khorana H. G. Hi . Amer. Chem. Soc. 1963. V. 85.
№ 10. P. 3821-3827.
8. Barone A. D., Tang I. Y., Carutliers M. H. // Nucl. Acids Res. 1984. V. 12. № 10.
P. 4051-4061.
9. Шмидт C., Кузнецова Л. Г., Романова E. A., Ниманн А О р е ц к а я Т. С.. Крыпец-
кая Н. Ф., Метелев В. Г., Шабарова 3. А. Ц Биоорган, химия. 1991. Т. 17. № 8.
С. 823-830.
10. Кузнецова С. А., Кубарева Е. А., Орецкая Т. С., Долинная Н. Г., Крынецкая Н. Ф.,
Громова E. С., Шабарова 3. А., Цех Д. II Биополимеры и клетка. 1987. Т. 3. № 6.
С. 283-289.
11. Rosenthal A., Schubert F., Cech D., Orezkaja T. S., Kasnezova S. A., Shabarova Z. A ■ Ц
Biomed. and biochim. acta. 1985. V. 44. № 10. P. 75-83.
Поступила в редакцию
20.XI.1991
После доработки
24.1.1992
E . A. K U BAR EVA, Е. A. ROMANOVA, Т. S. ORETSKAYA,
E . S . GROMOVA, Z. A. SHABAROVA
S Y N T H E S I S O F O L I G O D E O X Y R I B O N U C L E O T I D E S C ON TA IN IN G
5-FLUORO-2'-DEOXYCYTIDIN£
Chemical Department, М. V . Lomonosov Moscow Stale University, Mocsow
A synthesis of the phosphoroamidite derivative of 5-fluoro-2'-deoxycytidine which
allows one to introduce the modified nucleoside residue into the 5'-position of the oligodeoxyribonucleotide
by the standard solid phase phosphoroamidite method, has been
carried out. Oligonucleotides with 5-fluoro-2'-deoxycytidine residues in various positions
of the D N A strand are obtained by the combination of chemical and enzymatic syntheses.
750

Комментировать