РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО 2-ФЕНИЛБЕНЗОКСАЗОЛЬНОГО ПРОИЗВОДНОГО ДЕЗОКСИУРИДИНА

Читать онлайн: 
Текст статьи: 

© 1998 г. Е. В. Малахова, А. Д. Малахов, С. В. Кузницова, О. П. Варнавский*,
А. П. Кадуцкий**, Д. Т. Кожин***, В. А. Коршун, 10. А. Берлин#
Ин ститут бипорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117871, Москва, ГСП-7, ул. Миклу хо-Маклая, 16/10;
* Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН, Москва;
** Институт физико-органической химии Н АНБ , Минск;
*** Медико-биотехнологический институт при концерне “Бе лбиофарм”, Минск
П о с т у п и л а в р е д а к ц и ю 0 6 . 0 4 . 9 8 г . П р и н я т а к п е ч а т и 2 5 . 0 5 . 9 8 г.
С п о м о щ ь ю р е а к ц и и Х е к а - С о н о г а ш и р ы с и н т е з и р о в а н н о в ы й ф л у о р е с ц е н т н ы й н у к л е о з и д 5 - [ 4 - ( 2 - б е н -
з о к с а з о л и л ) ф е н и л ] э т и н и л - 2 ' - д е з о к с и у р и д и н и н а е г о о с н о в е п о л у ч е н ы р е а г е н т ы д л я м е ч е н и я о л и г о н
у к л е о т и д о в - т в е р д о ф а з н ы й н о с и т е л ь и З ' - а м и д о ф о с ф и т .
Ключ е вые слова: модифицированные нуклеозиды; 2-фенилбензоксазол.
Возрастающий интерес к химии 5-(алкин-1-
ильных) производных пиримидиновых нуклеози-
дов обусловлен в основном двумя полезными
свойствами этих соединений.
Во-первых, алкинсодержащий заместитель в
положении 5 оказался превосходным линкером
для присоединения флуоресцентных красителей
к 5'-трифосфатам ddU и ddC с точки зрения их
субстратных свойств в ДНК-полимеразной реакции
и использования в автоматизированных системах
секвенирования ДНК [2-5].
Во-вторых, поскольку 1-алкин-1-ильные (в частности,
пропинильные) заместители в этом положении
оказывают существенное стабилизирующее
влияние на ДНК-ДНК- и ДНК-РНК-дуп-
лексы (см. обзоры [6 , 7]), модифицированные
таким образом нуклеозиды находят применение в
качестве компонентов антисмысловых реагентов
(см., например, [8-14]), причем в этом случае введение
модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотиды
осуществляется в стандартных условиях
химического синтеза.
Сайт-специфическое введение флуорофоров в
синтетические олигонуклеотиды представляет
интерес с точки зрения применения таких конъюгатов
в качестве инструментов структурных исследований
нуклеиновых кислот, в частности, с
П р е д ы д у щ е е с о о б щ е н и е с м . [1 ].
С о к р а щ е н и я : D M A P - 4 - д и м е т и л а м и н о п и р и д и н , D M T -
4 , 4 ' - д и м е т о к с и т р и т и л , L C A A - G P G - а м и н о а л к и л и р о в а н н о е
с т е к л о с о п р е д е л е н н ы м р а з м е р о м п о р .
# А в т о р д л я п е р е п и с к и ( e -m a i l : y u b e r@ i b c h . s i o h c . r a s . r u ).
использованием резонансного безызлучательно-
го переноса энергии (fluorescence resonance energy
transfer, FRET) (см. обзоры [15-19], [20] и цитированные
там работы). Поэтому весьма перспективным
представляется присоединение красителей к
нуклеозидам таким образом, чтобы модифицированный
нуклеозид мог быть введен в стандартный
олигонуклеотидный синтез и чтобы модификация
существенно не нарушала специфичности узнавания
и прочности связывания конъюгата с комплементарной
последовательностью.
В рамках проводимых нами исследований флуоресцентных
производных нуклеозидов, в которых
флуорофор Ti-сопряжен с гетероциклическим
основанием через тройную связь [1 ], представляло
интерес получение такого 2 -фенилбензоксазоль-
ного производного. Как сам 2-фенилбензоксазол,
так и его производные флуоресцируют в ближней
УФ/видимой области и обладают высокими квантовыми
выходами флуоресценции [21]. Интересным
свойством 2 -арилбензоксазолов является также
способность к фотохимической димеризации
по С=1^-связи в соответствующие 1,3-диазетидины
[22-24].
В данной работе мы описываем синтез
5-[4-(2-бензоксазолил)фенил]этинил-2'-дезокси-
уридина (IX) и реагентов на его основе для твердофазного
амидофосфитного олигонуклеотид-
ного синтеза.
Наиболее удобным методом получения 5-(ал-
кин-1 -ильных) производных 2 '-дезоксиуридина является
взаимодействие соответствующего 5-иод-
68 8
Р ЕАГЕНТЫ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ 689
производного нуклеозида с терминальными алки-
нами в условиях реакции Хека-Соногаширы,
предусматривающих использование комплексного
палладиево-медного катализатора (см. обзор [25]).
Необходимый 2-(4-этинилфенил)бензоксазол
(III) был синтезирован двумя путями (схема 1).
Оба метода включают в себя сочетание галоген-
арена (I) с монозащищенным ацетиленом и последующее
деблокирование продукта реакции
Хека-Соногаширы с образованием целевого терминального
алкина (III).
В первом методе был использован 2-(4-иодфе-
нил)бензоксазол (1 а) и довольно дорогие реагенты
- триметилсилилацетилен, Рс1(РРЬ3) 4 и Ви4№ .
В этом случае обе стадии гладко протекают при
комнатной температуре, промежуточное вещество
(II) легко выделяется, и выход соединения (III)
высокий.
Во втором методе исходили из броманалога
(16), который был синтезирован конденсацией
2-аминофенола с 4-бромбензальдегидом с последующей
окислительной циклизацией образовавшегося
альдимина под действием иодозобензол-
диацетата в условиях, аналогичных описанным в
Рс1(РРЬ 3) 4/С и 1 /Е 1 ,Ы /ТН Р /{ о 0% (П)
(IV)
9 5 %
, п - В и 4№ / С Н С 1 3
8 7 % ^ (Ш)
К О Н / д и б е п :ю - 1 8 - к р а у и - 6 / о р п :ю л , 8 0 ° С
Схема 1.
О
ш
Асо^
О Ас (V)
N
О
(III)
РсКРРЬзУСиШзМЛГНР/Аг;
91% *
Схема 2.
4 БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998
690 МАЛАХОВА и др.
работе [26]. В этом случае при синтезе этиниль-
ного производного интермедиат (IV) нуждается в
более трудоемкой очистке, для деблокирования
требуется нагревание, и общий выход алкина (III)
несколько ниже. Однако существенно меньшая
стоимость реагентов делает этот путь более привлекательным
для крупномасштабного синтеза.
Алкинилирование нуклеозида проводили взаимодействием
3',5'-ди-0-ацетил-5-иод-2'-дезокси-
уридина (V) с алкином (III) в тетрагидрофуране
в присутствии Pd(PPh3)4, Cul и триэтила амина
(схема 2 ) при комнатной температуре в течение
12 ч. В результате с высоким выходом был получен
нормальный продукт сочетания - 3',5'-ди-0-
ацетил-5-[4-(2-бензоксазолил)фенил]этинил-2'-
дезоксиуридин (VI), причем дальнейшая гетероциклизация
целевого вещества практически не
происходила - побочный фуропиримидинон (VII)
образовывался лишь в следовых количествах.
В реакцию Хека-Соногаширы ал кин (IV) вводили
в небольшом (2 0 %) избытке, поскольку он
даже при тщательном удалении кислорода частично
расходовался на образование продукта
окислительной димеризации - 1,4-бис[4-(2-бен-
зоксазолил)фенил]бутадиина (VIII), слабо растворимого
в большинстве органических растворителей.
Использование диацетильного производного
5-иод-2'-дезоксиуридина в реакции сочетания целесообразно
из-за хорошей растворимости продукта
реакции (VI), который легко может быть
выделен хроматографией на силикагеле. Дезаце-
тилирование вещества (VI) водно-диоксановым
раствором аммиака дает 5-[4-(2-бензоксазо-
лил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридин (IX) с количественным
выходом (схема 3). Сочетание 5-иод-
2'-дезоксиуридина с алкином (III) в подходящем
растворителе (DMF/DMSO) сразу приводит к целевому
продукту (IX), но из-за малой растворимости
его выделение и очистка от бутадиина (VIII)
даже в небольших масштабах затруднительна.
Модифицированный нуклеозид (IX) может
быть введен в состав олигонуклеотидов и использован
в качестве флуоресцентной метки с потенци-
ОАс (VI) ОН
DMTCI/iinpimnii R — Н
74% Ч(Х); R = DMT
(Pr¿ N) 2РОСН2СН 2CN/MeCN//
/тетразолид динзопромиламмония/ 7 3 %
DMTO—I г\
Х з

(XI): R = P(NPr2')OCH2CH2CN
%R (XII): R = C(0)CH2CH2C(0)NH-LCAA-CPG
Схема 3.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ 691
А
Рис. 1. УФ-спектры 2-[4-(фенилэтинил)фенил]бен-
зоксазола (XIII) (/) и 3',5'-Ди-0-ацетил-5-[4-(2-бензок-
сазолил)феиил]этинил-2'-дезоксиуридина (VI) (2) в
ТНИ, концентрации 2 х 1СП5 М, / = 1 см.
альной зависимостью спектра флуоресценции от
микроокружения, в том числе от комплементарного
взаимодействия нуклеиновых кислот. На схеме
3 представлены синтезы амидофосфитного реагента
(XI) из нуклеозида (IX) по методикам, используемым
для обычных нуклеозидов [27], и
носителя (XII) по методу [28].
В качестве модельного соединения сочетанием
2-(4-иодфенил)бензоксазола (1а) с фенилацетиле-
ном синтезирован 2-[(4-фенилэтинил)фенил]бен-
зоксазол (4-(2-бензоксазолил)толан) (XIII), который
является аналогом соединений (VI) и (1Х)-(Х1),
содержащим фенильный остаток вместо нуклео-
зидного. При сравнении спектров поглощения веществ
(VI) и (XIII) в тетрагидрофуране (рис. 1) видно,
что при замене фенильного остатка на нуклео-
зидный общий вид спектра сохраняется, но
происходит небольшой (7-10 нм) батохромный
сдвиг и примерно полуторакратное уменьшение
молярного коэффициента поглощения.
Флуоресцентные свойства 2-фенилбензокса-
зола в составе нуклеозидов сохраняются. При
сравнении эмиссионных спектров защищенного
нуклеозида (VI) и модельного 4-(2-бензоксазо-
лил)толана (XIII) в THF (рис. 2) видно, что при
одинаковых концентрациях интенсивность эмиссии
нуклеозидного производного больше, чем фенильного
(при этом молярный коэффициент поглощения
(£3 3 7 ) у толана (ХШ) в 1.5 раза больше).
Спектр флуоресценции нуклеозида (VI) неструктурирован
(состоит из одной широкой полосы), однако
при 1 0 -кратном разбавлении приобретает
выраженную структуру и большее сходство со
спектром модельного соединения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использованы 2-аминофенол, 1,3-ди-
изопропилкарбодиимид, 4-диметиламинопиридин
(DMAP), 2-метил-3-бутин-2-ол, Bu4NF (Fluka), дй-
метокситритилхлорид, триметилсилилацетилен,
Cul, Pd(PPh3 ) 4 (Aldrich); остальные реактивы и растворители
- отечественного производства квалификации
“ч.” и “ч. д. а.”. Тетрагидрофуран перегоняли
над натрийбензофенонкетилом и хранили
над натрием. 3',5'-Ди-0-ацетил-5-иод-2'-дезокси-
уридин [29] и 2-цианэтоксибисдиизопропиламино-
фосфин и тетразолид диизопропиламмония [27],
а также 2-(4-иодфенил)бензоксазол [30] синтезировали,
как описано в литературе. За ходом реакций
следили с помощью ТСХ. Растворы высушиваИнтенсивность
люминесценции, отн. ед.
Рис. 2. Эмиссионные спектры 3’,5'-ди-0-ацетил-5-[4-(2-бензоксазолил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридина (VI), концентрации
2 х 1СГ5 М (/), 2 х КГ6 М (2), и 2-[4-(фенилэтинил)фенил]бензоксазола (XIII), концентрация 2 х 1СГ5 М (3) в THF.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998 4*
692 МАЛАХОВА и др.
ли Na2S 0 4, упаривание растворителей проводили
на роторном испарителе в вакууме водоструйного
насоса при температуре бани 30-50°С.
Температуры плавления определяли на нагревательном
столике tëoetius (не исправлены). Для
ТСХ использовали пластинки Kieselgel 60 F254
(Merck); пятна визуализировали в УФ-свете при
256 или 360 нм. Для колоночной хроматографии
использовали силикагель Kieselgel 60 (Merck),
размер частиц 40-63 мкм, или оксид алюминия
(Merck), активность II, размер частиц 40-100 мкм.
Спектры 'Н-ЯМР регистрировали на приборе
Bruker АС-500 (шкала 5, приведены химические
сдвиги относительно тетраметилсилана, внутренний
стандарт - примесь протонов в дейтерирован-
ных растворителях; приведены КССВ в герцах).
Спектр 3 'Р-ЯМР зарегистрирован на приборе Varian
XR-400, рабочая частота дл я31Р 161.9 МГц, шкала
S, химические сдвиги приведены относительно
85% Н3Р 0 4. Масс-спектры получали на приборе
Varian-MAT-44S (ионизация электронным ударом).
УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре
Shimadzu ОРС-65. Спектры флуоресценции
регистрировали на оптическом многоканальном
анализаторе Princeton Applied Research ОМА-2
с монохроматором Jobin-Yvon HR-320, для возбуждения
использовался азотный лазер ЛГ- 2 1 с
длиной волны 337 нм.
2-(4-Бромфенил)бензоксазол (16). 2-Амино-
фенол (5.0 г, 46 ммоль) при нагревании растворили
в этаноле (30 мл) и к полученному раствору
прибавили горячий раствор 4-бромбензальдегида
(9.436 г, 51 ммоль) в этаноле (20 мл). Реакционную
массу охладили до комнатной температуры и
выпавший осадок перекристаллизовали из этанола.
Выход основания Шиффа 12.16 г (96%); масс-
спектр, т /г +: 275, рассчитано 276.14 (C13H10BrNO).
Выделенный альдимин растворили при нагревании
в ацетонитриле ( 1 0 0 мл) и к полученному раствору
прибавили иодозобензолдиацетат (21.26 г,
6 6 ммоль). Реакционную смесь нагрели до кипения
и медленно охладили до комнатной температуры,
затем упарили досуха и остаток хроматографировали
на А120 3 в системе бензол-гексан, 7:3. Выход
соединения (16) 12.0 г (100% на основание Шиффа);
т. пл. 154°С (гексан) (т. пл. 154-155°С [30]); Rf
0.38 (бензол). Масс-спектр, m¡z+'. 275, 273; рассчитано
274.12 (C,3HgBrNO). ‘Н-ЯМР (CDC13):
8.15 (д, 2Н, J 8.1, На), 7.78 (м, 1Н, Н-4). 7.69 (д, 2Н,
7 8.1, НЬ), 7.58 (м, 1Н, Н-7), 7.37 (м, 2Н, Н-5, Н-6 ).
2-(4-Триметилсилилэтииилфенил)бензокса-
зол (II). К раствору 2-(4-иодфенил)бензоксазола
(1 а) (получен аналогично соответствующему бромиду
[30]) (0.90 г, 2.8 ммоль) в THF (15 мл) при перемешивании
в атмосфере аргона последовательно
прибавили триметилсилилацетилен (0.5 мл,
3.54 ммоль), Et3N (0.80 мл, 5.74 ммоль), Cul (53 мг,
0.28 ммоль) и Pd(Ph3P) 4 (162 мг, 0.14 ммоль) и продолжали
перемешивание при комнатной температуре
в течение 12 ч. Затем реакционную смесь разбавили
хлороформом (150 мл) и последовательно
промыли водой ( 1 0 0 мл), 1% раствором лимонной
кислоты (100 мл), 3% раствором EDTA-(NH4 ) 2 (2 х
х 100 мл) и снова водой (100 мл). Органический
слой высушили, растворитель упарили и остаток
хроматографировали на силикагеле в системе
гексан-бензол, 3 : 2. Выход 0.817 г (100%); т. пл.
156-157°С (гексан); R, 0.36 (бензол). Масс-спектр,
т /г+: 290; рассчитано 291.42 (Ci8H,7NOSi). 'Н-ЯМР
(CDCI3): 8.21 (д, 2Н, J 8.2, На), 7.78 (м, 1Н, Н-4), 7.63
(д, 2Н, J 8.2, НЬ), 7.58 (м, 1Н, Н-7), 7.37 (м, 2Н, 11-5,
Н-6 ), 0.32 (с, 9Н, СН3).
2-[4-(3-Гидрокси-3-метил-1-бутинил-1)фенил]-
бензоксазол (IV). К раствору 2-(4-бромфенил)бен-
зоксазола (16) (12.0 г, 44 ммоль) в смеси DMF
(150 мл) и DMSO (10 мл) в атмосфере аргона прибавили
2-метил-3-бутин-2-ол (13.0 мл, 132 ммоль),
Et3N (12.3 мл, 8 8 ммоль), Cul (419 мг, 2.2 ммоль),
PdCl2 (612 мг, 2.2 ммоль) и трифенилфосфин
(1.731 г, 6 . 6 ммоль). Реакционную смесь оставили
при комнатной температуре на 1 2 ч, разбавили
EtOAc (300 мл) и последовательно промыли водой
(5 х 200 мл), 3% раствором диаммониевой соли
EDTA (3 х 200 мл) и снова водой (200 мл). Органическую
фазу высушили, упарили и целевой продукт
выделили хроматографией на силикагеле
(элюирование градиентом ЕЮ Ас (0 — - 10%) в
бензоле). После перекристаллизации из смеси бен-
зол-гексан выход соединения (IV) составил 7.051 г
(58%); т. пл. 144-145°С (бензол); Rf 0.50 (бензол-
ЕЮАс, 4 : 1). Масс-спектр, ш/г+: 275, рассчитано
277.33 (Ci8H15N 0 2). ‘Н-ЯМР (CDC13): 8.21 (д, 2Н,
J 8.5, На), 7.79 (м, 1Н, Н-4), 7.59 (м, 1Н, Н-7), 7.56 (д,
2Н. J 8.5, НЪ), 7.37 (м, 2Н, Н-5, Н-6 ), 1.65 (с, 6 Н,
СН3).
2-(4-Этшшлфенил)бензоксазол (III). А. К раствору
2-[4-(3-гидрокси-3-метил-1 -бутинил-1 )фе-
нил]бензоксазола (IV) (3.55 г, 13 ммоль) в бензоле
(200 мл) прибавили дибензо-18-краун-6 (1.37 г,
3.8 ммоль) и реакционную смесь нагревали до
полного растворения осадка. К полученному раствору
прибавили растертый в порошок гидроксид
калия (2.157 г, 0.038 моль) и реакционную смесь
оставили при комнатной температуре на 12 ч. З а тем
осадок отфильтровали, фильтрат промыли
водой (3 х 1 0 0 мл), органический слой высушили
и упарили, и остаток хроматографировали на силикагеле
в бензоле. Выход этинилфенилбензок-
сазола (III) 2.48 г (87%); т. пл. 163-165°С (гексан);
Rf 0.35 (бензол). Масс-спектр, m/z+: 219, 218, рассчитано
219.24 (C15H9NO). 'Н-ЯМР (CDC!3): 8.23
(д, 2Н, J 8.7, На), 7.79 (м, 1Н, Н-4), 7.65 (д, 2Н, J 8.7,
Ш), 7.59 (м, 1Н, Н-7), 7.38 (м, 2Н, Н-5, Н-6 ), 3.24 (с,
1Н, CsCH)-
Б. К раствору 2-(4-триметилсилилэтинил)фе-
нилбензоксазола (II) (0.805 г, 2.76 ммоль) в хлороформе
(15 мл) прибавили тригидрат тетрабутил-
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ 693
аммонийфторида (0.938 г, 2.973 ммоль) и смесь
оставили на 1 ч при комнатной температуре. З а тем
реакционную массу разбавили хлороформом
(300 мл) и последовательно промыли водой
( 2 0 0 мл), 1% водным раствором лимонной кислоты
(100 мл) и снова водой (200 мл). Органический
слой высушили и упарили, и остаток хроматографировали
на силикагеле в бензоле. Выход соединения
(III) 0.577 г (95%).
3',5'-Ди-0-ацетил-5-[4-(2-бекзоксазолил)фе-
ншфтинил-2'-дезоксиурид1Ш (VI). К раствору 3',5'-
ди-0-ацетил-5-иод-2'-дезоксиурпдина (V) (0.749 г,
1.71 ммоль) в THF (15 мл) в атмосфере аргона
прибавили 2-(4-этинилфенил)бензоксазол (III)
(0.450 г, 2.052 ммоль), Et3N (0.5 мл, 3.59 ммоль),
Cul (0.033 г, 0.17 ммоль) и Pd(Ph3P) 4 (0.149 г,
0.129 ммоль) и реакционную смесь оставили на
12 ч при комнатной температуре. Затем отфильтровали
димер (VIII) (135 мг), фильтрат упарили,
остаток растворили в этилацетате (150 мл) и последовательно
промыли водой ( 1 0 0 мл), 1% раствором
лимонной кислоты (100 мл), 3% раствором
диаммониевой соли EDTA (3 х 100 мл) и водой
(100 мл). Органический слой высушили и упарили,
и остаток хроматографировали на силикагеле
(элюировали градиентом метанола (0 ■ -*■ 5%) в
смеси бензол-этилацетат, 85 : 15). Выход соединения
(VI) 0.822 г (91%). Rf 0.19 (5% МеОН в бензоле).
‘Н-ЯМР (CDC1,): 8.70 (уш. с, 1Н, NH), 8.23
(д, 2Н, J 8 .6 , На), 7.93 (с, 1Н, Н-6 ), 7.78 (м, 1 H, Н-
4"), 7.63 (д, 2Н, J 8 .6 , Ub), 7.59 (м, 1Н, Н-7"), 7.37 (м,
2Н, Н-5", Н-6 "), 6.33 (дд, 1Н, Jy Та 5.9, Jv ,.р 7.5, Н-1'),
5.28 (м, 1Н, Н-3'), 4.42 (д, 2Н, У4.5. 3.2, II-51), 4.33 (м,
1Н, Н-41), 2.60 (ддд, 1Н, 2JTa2f 14.1, JV2.a 5.9, У2.а>г
2.3, H-2'а), 2.30 (м, 1H, H-2'p), 2.20 (с, 311, СН3),
2.13 (с, ЗН, СН3).
В качестве побочного продукта был выделен
(см. выше) 1,4-бис[4-(2-бензоксазолил)фенил]бу-
гаднин-1,3 (VHI), т. пл. 168-170°С (толуол), Rf
0.62 (ЕЮАс-бензол, 1 : 1). ‘Н-ЯМР (CDC13): 8.27
(д, 4Н, J 8.3, На), 7.80 (м, 2Н, Н-4), 7.70 (д, 4Н, J 8.3,
Ш), 7.60 (м, 2Н, Н-7), 7.39 (м, 4Н, Н-5, Н-6 ).
Был также выделен продукт циклизации
3-(3',5'-ди-0-ацетил-2,-дезокси-р-£)-рибофуран«-
зил)-6-[4-(2-бензоксазолнл)фенил]фуро[2,3-*/]пи-
римидин-2-он (VII); Rf 0.24 (2% МеОН в СНС13).
‘Н-ЯМР (CDC13): 8.39 (с, Ш, Н-4), 8.34 (д, 2Н, J 8.4,
На), 7.92 (д, 2Н, J 8.4, НЬ), 7.80 (м, 1Н, Н-4"), 7.60 (м,
1Н, Н-7"), 7.38 (м, 2Н, Н-5", Н-6 "), 6 . 8 8 (с, III, Н-5),
6.35 (кажущийся т, 1Н. J V2-а - тр 6 .6 , Н-Г), 5.26
(м, 1Н, Н-3'), 4.44 (м, ЗН, Н-4', Н-5'), 3.02 (м, 1Н,
H-2'a), 2.17 (м, 1Н, H-2'p), 2.14 (с, ЗН, СН3), 2.09 (с,
ЗН,СН3).
5-[4-(2-Бензоксазолил)фенилэтинил]-2'-дезок-
сиуридин (IX). К раствору диацетата (VI) (1.0 г,
2 ммоль) в диоксане (40 мл) прибавили 25% водный
раствор аммиака ( 2 0 мл), смесь выдержали
при комнатной температуре 14 ч и упарили. Остаток
упарили с этанолом (3 х 1 0 0 мл) и перекрис-
таллизовали из смеси диоксан-вода. Выход продукта
аммонолиза (IX) 0.891 г (100%); /^0.28 (10%
МеОН в СН2С12). ‘Н-ЯМР (ОМБО-^): 8.48 (с, 1Н,
Н-6 ), 8.23 (д, 2Н, У 8.2, На), 8.23 (м, 2Н, Н-4", Н-7"),
7.71 (д, 2Н, J 8 .2 , Ш>), 7.46 (м, 2Н, Н-5", Н-6 "), 6.14
(кажущийсят, Ш,Уг га = 7 г гр6.4, Н-1'), 5.40(д, 1Н,
J 4.0, 3 01 [), 5.29 (тЛН, .1 4.7, 5'-ОН), 4.29 (м, 1Н,
Н-3'), 3.85 (м, 1Н, Н-4'), 3.63 (м, 2Н, Н-5’), 2.19 (м,
2Н, Н-2).
5'-0-(4,4'-Диметокснтритил)-5-[4-(2-бснзокса-
золил)фснил]этинил-2'-дезоксиуридин (X). 5-[4-(2-
бензоксазолил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридин (IX)
(890 мг, 2 ммоль) дважды упарили с пиридином
(2 х 30 мл), растворили в 80 мл пйридина и раствор
упарили на одну треть. Затем при перемешивании
прибавили 4,4'-диметокситритилхлорид (0.946 г,
2.79 ммоль), реакционную смесь выдержали 12 ч
при комнатной температуре и упарили. Маслообразный
остаток разбавили этилацетатом (150 мл)
и последовательно промыли насыщенными растворами
КаНС03 (2 х 100 мл) и ]ЧаС1 (2 х 100 мл).
Органический слой высушили и упарили, а остаток
хроматографировали на силикагеле (элюент
бензол-этилацетат (10: 1) + 0.1% Е ^ ) . Выход
1.117 г (74%); т. пл. 1 10-112°С (ЕЮАс); Я, 0.54
(20% МеОН в бензоле + 0.1% Е^И).
5'-0-(4,4'-Диметокситритил)-3'-6>-(диизопропил-
амино-2-циаиэтоксифосфинил)-5-[4-(2-бензоксазо-
лил)фенил]этинил-2'-дезоксиуридин (XI). 5'-0-(4,4'-
Диметокситритил)-5-[4-(2-бензоксазолил)фенил]~
этинил-2'-дезоксиуридин (X) (0.50 г, 0.669 ммоль)
дважды упарили с безводным ацетонитрилом ( 2 х
х 30 мл) и остаток растворили в безводном ацетонитриле
(80 мл). К полученному раствору при
перемешивании прибавили 2 -цианэтоксибисдиизо-
пропиламинофосфин (0.72 мл, 2.27 ммоль) и тетра-
золид диизопропиламмония (0.207 г, 1.20 ммоль).
Реакционную смесь упарили на одну треть, выдержали
1 2 ч при комнатной температуре, разбавили
этилацетатом (150 мл) и последовательно
промыли насыщенными растворами КаНС0 3 (3 х
х 100 мл) и КаС1 (2 х 100 мл). Органический слой
высушили и упарили, а остаток хроматографировали
на силикагеле в смеси бензол-этилацетат
(0 —» 100% ЕЮАс) + 3% Е г ^ . Выход амидофос-
фита (XI) 465 мг (73%). 0.74, 0.63 (диастереомеры).
3 'Р-ЯМР (С 0 3СИ): 151.896, 151.832 (диастереомеры,
~ 2 : 1 ).
Модифицированный носитель (XII). Носитель
500 А ЬСАА-СРС (300 мг), ацилированный
янтарным ангидридом по методу [28], суспендировали
в смеси ОМБ-пиридин (1 : 1; 4 мл), содержащей
монотритилированный нуклеозид (X)
(187 мг, 0.25 ммоль), 1,3-диизопропил карбодиимид
(280 мкл, 1.8 ммоль) и ЭМАР (20 мг), и выдержали
48 ч при комнатной температуре. Затем прибавили
раствор пентафторфенола ( 1 0 0 мг) в пиБИООРГАНИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ том 24 № 9 1998
694 МАЛАХОВА и др.
ридине ( 1 мл), смесь выдержали еще 1 2 ч, носитель
отфильтровали, суспендировали в 5% растворе
пирролидина в пиридине (3 мл), выдержали
1 0 мин, носитель отфильтровали и последовательно
промыли хлороформом, метанолом, ацетонитрилом
и эфиром (по 10 мл). Загрузка носителя
по нуклеозиду, определенная по поглощению
диметокситритильного катиона [31], составила
43.7 мкмоль/г.
2-[4-(Фенилэтинил)феннл]бензоксазол (4-(2-
бензоксазолил)толан) (XIII). К перемешиваемому
в атмосфере аргона раствору 1.00 г (3.11 ммоль)
2-(4-иодфенил)бензоксазола (1а) в 25 мл THF последовательно
прибавили фенилацетилен (0.41 мл,
3.74 ммоль), Et3N (0.9 мл, 6.46 ммоль), Cul (59 мг,
0.31 ммоль), Ph3P (82 мг, 0.31 ммоль) и PdCl2 (43 мг,
0.16 ммоль) и продолжали перемешивать 30 мин
при комнатной температуре. Реакционную смесь
разбавили 2 0 0 мл хлороформа и последовательно
промыли 1 0 0 мл порциями воды, 1% раствора лимонной
кислоты, 3% раствора диаммониевой соли
EDTA (трижды) и снова воды. Органическую
фазу высушили, упарили и остаток хроматографировали
на силикагеле в градиенте концентрации
бензола (25 — - 55%) в петролейном эфире.
После упаривания объединенных фракций остаток
перекристаллизовали из смеси петролейный
эфир-толуол 5 :1. Выход соединения (XIII) 0.564 г
(61%), т. пл. 192-193°С; Rj 0.22 (бензол). Масс-
спектр, ш/г+: 294; рассчитано 295.34 (C2 !Hl3NO).
Авторы выражают благодарность Ю.П. Козь-
мину (ИБХ РАН) за регистрацию масс-спектров,
Э.И. Лажко (НИИНА) за регистрацию 3 1Р-ЯМР-
спектра, Д.С. Стеценко (ИБХ РАН) за обсуждение
и Г.В. Малееву (ВКНЦ) за помощь в проведении
некоторых экспериментов. 'Н-ЯМР-спектры
получены на установке “Комплекс ЯМР-спектро-
метрии” при финансовой поддержке Миннауки
России (регистрационный номер 96-03-08).
Работа выполнена при поддержке Российского
фонда фундаментальных исследований, грант
№ 97-03-32927а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Коршун В.А., Манасова Е.В., Балакин К.В., Пр о хоренко
И.А., Бучацкий А.Г., Берлин Ю.А. // Биоорган.
химия. 1996. Т. 22. С. 923-925.
2. Prober J.M., Trainor G.L., Dam R.J., Hobbs F. W., Robertson
C.W., Zagursky R.J., Cocuzza A.J., Jensen MA.,
Baumeister K. // Science. 1987. V. 238. P. 336-341.
3. С o nfalone P.N. // J. Heterocycl. Chem. 1990. V. 27.
P. 31-46.
4. Lee L.G., Connell C.R., Woo S.L., Clieng R.D., М с Ardí
e В.F., Fuller C.W., Ha lloran N.D., Wilson R.K. II
Nucl. Acids Res. 1992. V. 20. P. 2471-2483.
5. Rosenblum B.B., Lee L.G., Spurgeon S.L., Khan S.H.,
Menchen S.M., Heiner C.R., Chen S.M. // Nucl. Acids
Res. 1997. V. 25. P. 4500-4504.
6. De Mesmaeker A., Häner R., Martin P., Moser H.E. //
Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 366-374.
7. Freier S.M., Altmann K.-H. // Nuct. Acids Res. 1997.
V. 25. P. 4429-4443.
8. Wagner R.W., Matteucci M.D., Lewis J.G., Gutierrez
A.J., Moulds C., Froehler B.C. // Science. 1993.
V. 260. P. 1510-1513.
9. Fenster S.D., Wagner R.W., Froehler B.C., Chin D.J. //
Biochemistry. 1994. V. 33. P. 8391-8398.
10. Moulds C., Lewis J.G., Froehler B.C., Grant D., Hu ang
Т., Milligan J.F., Matteucci M.D., Wagner R.W. //
Biochemistry. 1995. V. 34. P. 5044—5053.
11. Wagner R.W., Matteucci M .D., Grant D., HiuingT., Froehler
B.C. // Nature Biotechnol. 1996. V. 14. P. 840-844.
12. Flanagan W.M., Su L.L., Wagner R.W. // Nature Biotechnol.
1996. V. 14. P. 1139-1145.
13. Flanagan W.M., Kothavale A., Wagner R.W. //Nucl. Acids
Res. 1996. V. 24. P. 2936-2941.
14. Gutierrez A.J., Matteucci M.D., Grant D., MatsumuraS.,
Wagner R.W., Froehler B.C. // Biochemistry.
1997. V. 36. P. 743-748.
15. Clegg R.M. // Meth. Enzymol. 1992. V. 211. P. 353-388.
16. Wu P., BrandL. // Anal. Biochem. 1994. V. 218. P. 1-13.
17. Selvin P.R. //Meth. Enzymol. 1995. V. 246. P. 300-334.
18. Clegg R.M. II Fluorescence Imaging Spectroscopy and
Microscopy / Eds X.F. Wang, B. Herman. New York:
Wiley, 1996. P. 179-252.
19. Glazer A.N., Mathies R.A. // Curr. Opin. Biotechnol.
1997. V. 8. P. 94-102.
20. Ota N., Hirano K., Warashina M., Andrus A., Mullah B.,
Hatanaka K., Taira K. II Nucl. Acids Res. 1998. V. 26.
P. 735-743.
21. Reiser A., Leyshon L.J., Saunders D., Mijovic M.V.,
Bright A., Bobie J. // J. Am. Chem. Soc. 1972. V. 94.
P. 2414-2421.
22. Roussilhe J., Despax B., Lopez A., Pai lions N. I I
J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1982. P. 380-381.
23. Roussilhe J., Farcin E., Lopez A., Despax B., PaillousN.
Hi. Org. Chem. 1983. V. 48. P. 3736-3741.
24. Fery-Forgues S., Paillous N. // J. Org. Chem. 1986.
V. 51. P. 672-677.
25. Коршун В.A., Манасова Е.В., Бер ли н Ю.А. // Биоорган.
химия. 1997. Т. 23. С. 324-386.
26. Varma R.S., Saini R.K., Prakash О. // Tetrahedron Lett.
1997. V. 38. P. 2621-2622.
27. Caruthers M.H., Barone A.D., Beaucage S.L.,
Dodds D.R., Fisher E.F., McBride L.J., Matteucci M.,
StabinskyZ., TangJ.-Y. //Meth. Enzymcl. 1987. V. 154.
P. 287-313.
28. Damha M.J., Giannaris P.A., Zabaiylo S.V. 11 Nucl. Acids
Res. 1990. V. 18. P. 3813-3821.
29. Robins M.J., Barr P.J. // J. Org. Chem. 1983. V. 48.
P. 1854-1862.
30. So Y.-H., Zaleski J.M., Mur lick C., Ellaboudy A. // Macromolecules.
1996. V. 29. P. 2783-2795.
31. Atkinson Т., Smith М. II Oligonucleotide Synthesis: A
Practical Approach //Ed. M.H. Gait. 1RL Press: Oxford,
1984. P. 36-81.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998
Reagents for Introducing a Fluorescent Deoxyuridine 2-Phenylbenzoxazole
Derivative into Oligonucleotides
E. V. Malakhova*, A. D. Malakhov*, S. V. Kuznitsova*, O. P. Varnavskii**,
A. P. Kadutskii***, D. T. Kozhich****, V. A. Korshun*, and Yu. A. Berlin*#
* Shemyakin-Ovchinnikov Institute o f Bioorganic Chemistry, Russain Academy o f Sciences,
id. Miklukho-Maklaya 16/JO, GSP-7 Moscow, / 17871 Russia
** Lebedev Physical Institute, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
*** Institute o f Physical Organic Chemistry, National Academy o f Sciences o f Belarus, Minsk, Belarus
****Medico-biotechnological Institute, Belbiopharm, Minsk, Belarus
Using the Heck-Sonogashira reaction, a new fluorescent nucleoside, 5-[4-(2-benzoxazolyl)phenyl]ethynyl-
2'-deoxyuridine, was synthesized and converted into oligonucleotide-labeling reagents, namely, the З'-phosphoramidite
and a functionalized solid support.
Key words: modified nucleosides, 2-phenylbenzoxazole
РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ В ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ 695
# To whom correspondence should be addressed; e-mail: yuber@ibch.siobc.ras.ru.
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ том 24 № 9 1998

Комментировать