МОДУЛЯЦИЯ МЕМБРАНОАКТИВИОСТИ ФЕРМЕНТА В СИСТЕМЕ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ ИЗМЕНЕНИЕМ pH СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТ АЗЫ)

Читать онлайн: 
Текст статьи: 

БИОО Р ГА Н И Ч Е С К А Я ХИМИЯ
Том 18 * № 6 * 1992
УДК 577.152.313*1.04
© 1992 г. С. I I . Н а м ет к и н , Л. К . Д а д а я н ,
А. В . К а б а н о в , А. В. Л е в аш о в
Московский государственный- университет им. М. В. Ломоносова,
кафедра химической э/иимологин
Изучена регуляция мембраноактивных свойств щелочной фосфатазы из кишок
теленка в системе обращенных мицелл аэрозоля О Т (АОТ) в октане. Найдено, что
зависимость каталитической активности щелочной фосфатазы от концентрации П А В
при постоянной степени гидратации, характеризующая мембранотропность ферментов,
модулируется изменением pH среды. Не исключено, что при изменении pH
происходит изменение конформации белковой молекулы, сопровождающееся экспонированием
наружу якорных участков, обеспечивающих взаимодействие фермента
с мицеллярной матрицей,
Многие ферменты в процессе метаболизма изменяют спою локализацию,
переходя из растворимой формы в мембраносвязанную и наоборот
И]. Такой переход может быть обусловлен, например, введением в молекулу
белка или отщеплением от нее гидрофобного якоря, образованного
нептидом или группами небелковой природы (фосфолипидами, жирными
кислотами) [2—6]. Появление на поверхности белка якорной группы может
быть также обусловлено конформационными переходами белковой
глобулы. Выяснение влияния таких переходов на кинетические свойства
ферментов представляет значительный интерес. Однако при изучении
свойств двух форм ферментов методами классической энзимологии (в водных
растворах) различия между ними, как правило, не обнаруживаются
[2, 3, 7].
Эта задача может быть решена при использовании в качестве среды
для ферментативной реакции систем гидратированных обращенных мицелл
ПАВ в органических растворителях: как было показано на примере
различных ферментов (^-глутамилтрансфераза, аминопептндаза [8)). но
закономерностям катализа в этих системах их мембранные и растворимые
формы сильно различаются.
Целью данной работы явилось сравнительное изучение кинетических
закономерностей функционирования мембранной и растворимой форм
щелочной фосфатазы из кишок теленка в системе обращенных мицелл
аэрозоля ОТ в октане.
Известно, что варьирование концентрации АОТ при постоянной степени
его гидратации сопровождается изменением числа (концентрации)
мицелл в системе. При этом в достаточно широком диапазоне концентраций
ПАВ основные характеристики мицелл, и в частности их размеры,
не изменяются [9, 10). На этом основании можно полагать, что катали-
Сокращения: П А В - поверхностно-активное вещество, аэрозоль ОТ (АОТ) - натриевая
соль ди-2-отилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты, ТГч'ВЭ - тринитро-
оензолсульфокислота, вОЯ — додецклсульфат натрия.
Рис. 1. Очистка щелочной фосфатазы из кишок теленка гель-фильтрацией на Тоуо-
pearl HW-45 (а) и хроматографией на октил-силохроме (б). I - гидрофильная, II—
IV - гидрофобные фракции. Закрашенными столбиками показаны уровни активности
фермента во фракциях. По данным электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии
SDS, во фракциях I — IV содержится гомогенная щелочная фосфатаза
(A fr ® 7 0 ООО)
тическая активность солюбилизированных ферментов при постоянной степени
гидратации не должна зависеть от концентрации ПАВ.
Справедливость этого предположения была подтверждена для ряда
гидрофильных ферментов, таких, как а-химотрипсин [11], трипсин [12],
липоксигеназа [13], растворимые формы ^-глутамилтрансферазы и амино-
пептидазы [8].
Однако существует вторая группа ферментов (пероксидаза [14], кислая
фосфатаза [15], лакказа [16], мембранные формы ч-глутамилтранс»
феразы и аминопептидазы [8]), каталитическая активность которых в системах
обращенных мицелл существенно зависит от концентрации ПАВ.
Причина этого явления, по-видимому, заключается в способности этих
ферментов взаимодействовать с мицеллярной матрицей. Дело в том, что
для этой группы ферментов характерно наличие в их молекулах якорных
групп (углеводной или липидной природы), принимающих участие во
взаимодействии таких ферментов с биомембранами. Нами было показано,
что искусственное введение гидрофобного якоря (остатка жирной кислоты)
в молекулу а-химотрипсина (фермент первой группы) приводит к
появлению зависимости его каталитической активности от концентрации
ПАВ, т. е. «превращает» его в фермент второй группы [11].
Рис. 2. Зависимость от степени гидратации (шо=[Н20]/[АОТ]) удельной максимальной
скорости (У/[Ео]) гидролиза п-нитрофенилфосфата, катализируемого в системе
обращенных мицелл А О Т в октане гидрофильной фракцией 1 (а) и гидрофобной
фракцией IV (б) щелочной фосфатазы. Условия определения: 50 м М карбонатный
буфер, p H 11,75; [Е0]=0,5-5 мкМ; [АОТ], М: 0,038 (7), 0,075 (2), 0,15 (3), 0,3 (4).
Приведена шкала радиусов (гс) внутренней полости обращенных мицелл, на которой
стрелками отмечены размеры мономера (М) и димера (Мг) фермента ([21])
Рис. 3. Зависимости от концентрации П А В удельной максимальной скорости гидролиза
л-нитрофенилфосфата, катализируемого в системе обращенных мицелл А О Т в
октане гидрофобной фракцией IV щелочной фосфатазы. Условия определения: 50 м М
карбонатный буфер: [Н20] / [АОТ]=25; [Е0]=0,1-1,0 мкМ; pH: 9,3 (1), 9,7 (2), 9,9
(3), 10,5 (4), 11,0 (5), 11,75 {6). Зависимости приведены в полугиперболических координатах
Рис. 4. Влияние pH водной фазы на активность гидрофобной фракции IV щелочной
фосфатазы (а), выраженную как тангенс угла наклона прямых на рис. 3, и на интенсивность
ее флуоресценции (б). Условия определения: среда — обращенные мицеллы
А О Т в октане (ГН20]/[АОТ]=25) (1, 4), Бр и д ж 96 в циклогексане ([НгО]/
/[Бридж 96]) = 10) (2) или вода (3), Я„03о=290 нм, Яисп=337 нм; [Е0] = 14 н М
10 30
Гр,Я
50
огоо
0.
10
Щ
ю /г
pH
Рис. 2 Рис..
О 0 ,0 5 0,1
СЛОТАМ
Рис. 3
Таким образом, зависимость каталитической активности от концентрации
ПАВ может служить простым информативным тестом на мембране
тропность ферментов [8, 11].
Ранее в работе [16] был сделан вывод, что каталитическая актинность
щелочной фосфатазы из кишечника теленка в системе обращенных мицелл
А ОТ в октане не зависит от концентрации ПАВ. Вместе с тем хорошо известно,
что щелочная фосфатаза — классический мембранный фермент,
связанный со щеточной каймой с помощью гидрофобного якоря [17. 181.
Как правило, в препаратах щелочной фосфатазы содержится множество-
изоформ фермента (19, 20] (как природных, так, по-видимому, и в о
779
кусственно образовавшихся в процессе выделения). Мы провели очистку
коммерческого образца щелочной фосфатазы (препарат фирмы «Sigma»)
гель-фильтрацией па Toyopeari TSK-45 и гидрофобной хроматографией
па октил-сплохроме. Оказалось (рис. 1), что в исследованном образце фермента
содержатся по крайней, мере четыре изоформы, различающиеся по
гпдрофобпости.
Нид зависпмостен каталитической активности от степени гидратации в
системе обращенных мицелл ЛОТ в октане для этих изоформ оказывается
схожим (рис.. 2): во всех случаях на этих зависимостях обнаруживаются
два максимума. Объяснение такого вида зависимости дано в работе [21);
при варьировании степени гидратации ПАВ происходит изменение надмолекулярной
структуры щелочной фосфатазы, и наблюдаемые максиму
мы соответствуют ([)ункционпроваиню мономера и димера фермента [21].
Каталитическая активность наиболее гидрофильной изоформы (фракция
1. рис. 1) не зависит от концентрации ЛОТ (данные не приведены на
рисунках). Для остальных (гидрофобных) изоформ (фракции II —IV)
обнаруживается зависимость каталитической активности от концентрации
ЛО Г, которая, как следует из проведенного выше обсуждения, указывает
на мембрапотроппость фермента. J3 отличие от ранее обсуждавшихся случаев
на проявление этих зависимостей влияет pH водной микрофазы
обращенных м и цел л ,
15 условиях pH-оптимума ферментативной реакции (pH 10,0— 10,5), наблюдаемого
в водном растворе, каталитическая активность гидрофобных
изоформ щелочной фосфатазы не зависит от концентрации ТТЛ В (рис. 3)
Такая зависимость, однако, проявляется в системе обращенных мицелл
при рП<!),7 и pH>10,5 (рис. 3). Наблюдаемые в этих условиях зависимости
линеаризуются в полугинерболических координатах. Тангенс угла
ни клона соответствующих прямых, характеризующий «чувствительность);
фермента к изменению концентрации ПАВ, определяется величиной pH
вводимого в мицеллнрную систему водного раствора (рис. 4а).
Нолу чей п ын результаты можно представить в тройной системе координат.
в которой по осям отложены каталитическая активность (У/[Е„]),
степень гидратации [1ТО] / [ЛОТ] и концентрация ПАВ ([ЛОТ]) (рис. 5).
При атом зависимости, приведенные па рис.. 2, являются соответствующими
сечениями поверхностей каталитической активности. В случае не-
ме.мбранпой формы щелочной фосфатазы значения каталитической активности
при постоянных степенях гидратации не зависят от концентрации
11Л В (рис. Г>6).
Следует отметить, что зависимость каталитической активности от концентрации
ПАВ, модулируемая pH, обнаруживается для щелочной фосфатазы
п в системе обращенных мицелл, образованных неионным ПАВ —
бридж (.Ж в циклогексапо (данные не приведены на рисунках). Таким
образом, наблюдаемое явление, по-видимому, не мож.ел быть объяснено
электростатическим взаимодействием фермента с отрицательно заряженными
сульфатными группами ЛОТ.
Мы предположил», что при изменении pH происходят изменения кон
формации щелочной фосфатазы, сопровождающиеся экранированием/экспонированием
участков белковой глобулы, обусловливающих, взаимодействие
этого фермента с мембраной. Действительно, при pH »10,0- 10,5 на
зависимостях интенсивности флуоресценции щелочной фосфатазы от pH
наблюдается излом, указывающий на конформационный переход в белковой
молекуле (рис. 46).
Отметим, что, согласно данным [22], мембранотролные свойства щелочной
фосфатазы, и в частности связанная с ними способность фермента
к транспорту фосфата через мембрану, модулируются изменением pH.
780
Рис. 5. Зависимости каталитической активности .мембранной (ni н пемембрапной (<>)
форм щелочной фоефатазы от степени гидратации и концентрации И Л И при pH буферного
раствора И,7.г> и тройной системе координат
0,1 0.2 0 ,3
СЛОТАМ
Рис. fi. Зависимости от концентрации НЛО удельной .максимальной скорости (l^/[EoJ)
гидролиза л-нитрофенилфосфата, катализируемого п системе обращенных мицелл ДОТ
л октане гидрофобной фракцией IV щелочной фоефатазы (а) и ферментом, модифицированным
остатками стеариновой кислоты (б) Условия определения: [И-Д)|/
/[ЛОТ¡-25 (50 м М карбонатный буфер); [Еоj — (1,1 --1,0 мкМ а pH 11,75, до (!) в
после (2) обработки папаином; 6 pli 10,0 (.У), 10,5 W 12,0 (5). Зависимости приведет,!
а полу гиперболических координатах
В литературе нет однозначного мнения о природе якоря, удерживающего
щелочную фосфата:iу на мембранах щеточной каймы. Предполагают,
однако, что он образован фосфатидилинозитом, ковалентно присоединен
ным к белковой глобуле через гликанопыи мостик [5. 18]. Известно, что
обработка мембранных форм ряда ферментов папаином [2, 17] приводят
к отщеплению гидрофобного якоря и переходу фермента в растворимую
форму. Мы использовали этот метод (2, 17] для перевода щелочной фосфата
зы и растворимую форму и убедились, что обработка папаином вызывает
исчезновение наблюдаемой для гидрофобных изоформ щелочной
фоефатазы зависимости каталитической активности от копцентрации
ПАВ (рис. 6а). В то же время эта зависимость вновь появляется после
перевода обработанного папаином фермента в мембранную форму
781
путем химической модификации его свободных аминогрупп остатками
стеариновой кислоты (рис. 66). По данным титрования аминогрупп
щелочной фосфатазы с помощью TNBS, обработка фермента папаином
приводит 1C появлению дополнительных аминогрупп (общее число их изменяется
на 12%) в молекуле белка; именно на столько же уменьшается
количество титруемых аминогрупп после модификации стеароилхдоридом.
Вероятно, свободные аминогруппы, образующиеся вследствие воздействия
папаина, более (либо единственно) доступны при модификации.
Отметим также, что полученная таким образом искусственная гидрофобная
форма щелочной фосфатазы проявляет зависимость каталитической
активности от концентрации IIА В во всем исследованном диапазоне
pH (10,0—12,0) (рис. 66). Мы предположили, что остатки стеариновой
кислоты на поверхности белковой глобулы не экранируются при изменении
pH, как это происходит в случае исходной гидрофобной формы щелочной
фосфатазы.
Экспериментальная часть
Щелочную фосфатазу (КФ 3.1.3.1) из кишок теленка (Sigma, США)
очищали гель-фильтрацией на Toyopearl TSK-45 и гидрофобной хроматографией
на октил-силохроме в 2Г) мМ карбонатном буфере (pH 0,5).
Активность выделенного фермента (1 и IV фракции) составляла около
100 ед./мг (одна единица соответствует активности такого количества фермента,
которое за 1 мин гидролизует 1 мкмоль п-нитрофенилфосфата при
pH 10,4 а 25° С).
Аэрозоль ОТ (Merck, ФРГ) использовали без дополнительной очистки.
Методом НК-спектроскопии [141 установлено, что в этом препарат*!
содержалось 0,5 моль воды на 1 моль А ОТ.
п-Нитрофенилфосфат натрия — препарат фирмы Sigma (США).
Остальные использованные в работе реактивы были отечественного
производства.
Измерение спорости ферментативной реакции, в системе обращенных
мицелл [21]. В 2 мл 0,3 М раствора А ОТ в октане солюбилизировали 5—
20 мкл 5—150 мкМ раствора щелочной фосфатазы и 20—350 мкд 10-
250 мМ раствора /г-нитрофеннлфосфата в карбонатном буфере (pH 9,3—
12,0). Для получения мицеллярпых. систем с различными концентрациями
АОТ исходный раствор разбавляли октаном.
Скорость реакции образования д-нитрофенолят-пона определяли
спектрофотометрически при 400 нм и 25° С. (В независимом эксперименте,
измеряли коэффициенты молярного поглощения «-нитрофенолят иона в
системе обращенных мицелл при различных значениях pH, степенях гидратации
и концентрациях АОТ.) Использовали спектрофотометр Beckman
25 (США) с термостатируемым кюветным: отделением. В работе, анализируются
значения приведенной максимальной скорости (У/[Ео])- Скорость
реакции измеряли в условиях насыщения фермента субстратом.
Обработка щелочной фосфатазы папаином. К 1 мл 10 мкМ раствора
щелочной фосфатазы в 50 мМ трис-НС1-буфере (pH 7,5) добавляли
100 мкл 0,4 мМ раствора папаина (Sigma). После 1 ч инкубации с панаи-
ном при 20° С фермент отделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-150.
Модификация щелочной, фосфатазы стеароилхлоридом [11]. В 10 мл
0,1 М раствора АОТ в октане солюбилизировали 450 мкл 10 мкМ раствора
щелочной фосфатазы в боратном буфере (pH 9,5). Систему интенсивно
встряхивали до достижения оптической прозрачности и. затем добавляли
•45 мкл 10 мМ раствора стеароилхлорида в октане. Модифицированный
фермент выделяли из системы осаждением ацетоном.
Титрование аминогрупп с помощью TNBS [23]. К 1 мл 10 мкМ. рас
тнора образца в 0,1 М боратном буфере (pH 9,5) добавляли 25 мкл водного
раствора 30 мМ раствора TNBS. После 1 ч инкубации при 25° С определяли
изменение оптической плотности при 420 нм. Концентрацию белка
определяли по поглощению при 280 нм.
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Werner М., Garret С., Chiu A., Klempner ¿.//Clin. Chem. 1982. V. 28. P. 2351-2358.
2. Maroux S., Louvard D. // Gastroenterol. Clin. Biol. 1977. V. 1. P. 377-388.
3. Tate S. S., Meister A. // Mol. Cell. Biochem. 1981. V. 39. P. 357-368.
4. Cross G. А, М.Ц Cell. 1987. V. 48. P. 179-181.
5. Low M. G. /I Biochem. J. 1987. V. 244. P. 1-13.
6. Schmidt M. F. G. /j Cun. Top. Microbiol. Immunol. 1983. V. 102. P. 101-129.
7. Колесанова E. Ф., Ротанова Т. В., Америк А. Ю., Гинодман Л. М., Антонов В. К. //
Биоорган, химия. 1986. Т. 12. № 3. С. 340-356.
8. Наметкин С. Н.. Кабанов А. В., Евтушенко Г. Н., Клячко Н. Л., Колесанова Е. Ф.,
Ротанова Т. В., Чернов Н. Н., Левашов А. В. Ц Биоорган, химия. 1991. Т. 17. № 4.
С. 442-447.
9. Structure and Reactivity in Reverse Micelles/Ed. Pileni M. P. Amsterdam, Oxford,
N e w York, Tokyo: Elsevier, 1989.
10. Кабанов А. В., Клячко H. Л., Пшежецкий А. В., Наметкин С. H., Мартинек К.,
Левашов А. В. // Молекулярн. биология. 1987. Т. 21. Вып. 1. С. 275-286.
11. Кабанов А. В., Левашов А. В., Мартинек К. / / Вести. МГУ. Сер. 2. Химия. 1986,
Т. 27. С. 591-594.
12. Левашов А. В., Клячко Н. Л., Пантин В. И., Хмельницкий Ю. Л., Мартинек K. j j
Биоорган, химия. 1*980. Т. 6. № 6. С. 920-943.
13. Левашов А. В. Катализ ферментами в системах обращенных мицелл. Дис. ... докт.
хим. наук. М.: МГУ, 1987.
14. Клячко Н. Л., Левашов А. В., Мартинек К. // Молекуляр. биология. 1984. Т. 18,
№ 4. С. 1019-1031.
15. Левашов А. В., Клячко Н. Л., Пшежецкий А. В., Березин И. В., Котрикадзе Н.Г.,
Ломсадзе Б. А., Мартинек К. Ц Докл. А Н СССР. 1986. Т. 289. № 5. С. 1271-1273.
16. Пшежецкий А. В., Меркер Ш., Клячко Н. //., Пепанян Г. С., Мартинек К., Левашов
А. В. // Биохимия. 1988. Т. 53. Вып. 6. С. 1013-1016.
17. Wulkan R. W., Huijskes-Heins М. I. Е., Leijn.se В. // Int. J. Biochem. 1986. V. IS,
P. 1045-1051.
18. Seetharam В., Tiruppathi С., Alpers D. H./l Biochemie. 1985. V. 24. P. 6603-6608.
19. Fernley N. К.Ц The Enzymes. V. 4. 3rd edn./Ed. Boyer P. D. N. Y.: Acad. Press,
1971. P. 417-447.
20. Herz F./l Experientia. 1985. V. 41. № 11. P. 1358-1361.
21. Наметкин С. H., Кабанов А. В., Клячко Н. Л., Левашов А. В. // Биоорган, химия.
1991. Т. 17. № 5. С. 606-609.
22. Hirano К., Jnzumi Y., Sugiura М., Mori Y., Toyoshi К., lino S., Suzuki H., Oda Т.Ц
Chem. Pharm. 1984. V. 32. № 1. P. 198-204.
23. Habeeb A. F./l Analyt. Biochem. 1966. V. 14. P. 328.
Поступила в редакцию
15.XI.199i
S. N. NAMETKIN, A . K. D ADAJAN, A. V. KABANOV, A. V. LEVASHOV
MODULATION OF THE ENZYME’S MEMBRANE ACTIVITY IN THE
REVERSED MICELLES SYSTEM BY pH VARIATION (EXAMPLIFIED
WITH ALKALINE PHOSPHATASE)
Division of Chemical Enzymology, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow
Regulation of the membrane active properties of alkaline phosphatase from calf intestinal
mucosa in reversed micelles of Aerosol O T (AOT) in octane was studied. The dependence
of the catalytic activity on the surfactant concentration at the constant hydra
tion degree, which caractérisés the membrane activity of enzymes, is modulated through
p H variation. The variation may cause conformational changes of the protein molecule,
resulting in exposition of anchor groups which provide the interaction of the enzyme
with the micellar matrix.
783

Комментировать