ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ВИРУСОВ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ

Читать онлайн: 
Текст статьи: 

БИ О ОР ГАНИЧ Е С КАЯ ХИМИЯ
Т о м 18 * № 6 * 1 9 9 2
УДК 578.825.083.3
© 1992 г. B .C . Иванов, Л. Д . Чикин,
З .К. Суворова*, А, Т. Кожин, В.Т Иванов
Институт биоорганической химии им. М М. Шемякина. РАН, Москва;
* Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии, Москва
С целью подбора синтетических пептидных антигенов для диагностики В И Ч с
помощью различных алгоритмом был проведен поиск вероятных антигенных детер
минант белков, кодируемых генами gag, pol, спи, nef В И Ч -i и В И Ч -2, и твердофаз
и ы м методом синтезировано свыше 40 пептидов, соответствующих предсказанным
участкам. Антигенные свойства пептидов исследованы в И Ф А на панелях сывороток,
содержащих антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2. Исследована возможность использования
ш птидов для ранней диагностики заболевания ВИЧ.
Синтетические пептиды являются мощным инструментом в иммунохи-
мических исследованиях, особенно в качестве иммуногенов и антигенов
для энитонного картирования вирусных белков. Эти подходы интенсивно
используются нри изучении вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ)
этиологических агентов СПИД. В ряде работ [1—41 было предложено
использовать синтетические пептиды в качестве антигенов в иммунофер-
ментном анализе для обнаружения антител к ВИЧ в сыворотке крови.
Использование в качестве антигенов синтетических пептидов вместо разрушенного
вируса или рекомбинантных вирусных белков имеет несомненные
преимущества. Пептиды легко синтезировать и получить в виде химически
чистых веществ, что обусловливает высокую степень воспроизводимости
результатов анализа. С помощью пептидов можно наиболее точно
определить антигенные детерминанты белков, что заметно увеличивает
специфичность анализа. Благодаря большой антигенной плотности иммобилизованных
пептидов увеличивается чувствительность тест-систем.
И, что немаловажно, при использовании пептидных антигенов отсутствует
опасность заражения антигеном.
Цель нашей работы — поиск антигенных детерминант (В-энитопов)
ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью синтетических пептидов. Большая часть иммунного
ответа при инфицировании ВИЧ направлена против структурных
и регуляторных белков, кодируемых генами env, gag, pot и nef [5), поэтому
поиск В-эпитопов мы осуществляли в этих белках. Нами были использованы
традиционные методы предсказания антигенных участков — были
рассчитаны профили гидрофильное™ [6], антигенности (7), подвижности
основной цепи [8], вероятная вторичная структура [9] данных белков,
йосле сопоставления всех расчетных данных были выбраны наиболее перспективные
в антигенном отношении пептиды, причем предпочтение отдавалось
пептидам из консервативных участков белков {10].
Так, из белков сердцевины вириона было выбрано для синтеза 8 фраг
ментов в основном из белка р24 (рисунок, а, табл. 1), антитела к которому
Принятые сокращения: X — норлейцин, В - а-аминомасляная кислота, Z — D-ала
нин, T F A — трифторуксусная кислота, Т Ф И Ф А - твердофазный иммуноферментный
анализ.
Та б лица 1
Реактивиость синтетических непткдоп в ТФИФА на панели сывороток,
содержащих антитела к ВИЧ-1
У ч а с то к Г ек . и одиП
еп ти д Б ел о к последовательно
ex к *
рующи й
белок
Результат ТФИФА **
СП-65 р 17 19-35 g a g 11/82 (13,4%)
СП-69 р17 51-67 g a g 7/82 (8,5%)
СП-71 р 17 109-123 g a g 6/76 (7,9%)
СП-38 р24 224-242 g a g 4/12.3 (3,3%)
CII-37 р24 284-299 g a g 10/123 (8,1%)
И-1 р24 351-363 g a g 5/169 (3,0%)
СП-40 р24 356-373 g a g 24/185 (13,0%)
П-2 р15 486-500 g a g 5/130 (3,8%)
СП-45 рбб/51 110-123 po l 17/149 (11,4%)
СП-50 рбб/51 226-239 poi- 25/125 (16,6%)
СП-48 рбб/51 322-340 p o i 18/150 (12,0%)
CII-42 рбб/51 380-394 p o l 3/124 (2,4%)
СП-46 рбб/51 572-588 p o l 46/150 (30,7%)
СП-61 рбб/51 580-596 p o l 5/144 (3,5%)
СП-67 рбб/51 673-690 p o l 3/82 (3,7 %)
СП-26 g p l2 0 492-517 e n v 172/250 (68,8%)
СИ-18 g p l 20 500-517 en V 100/216 (46.5%)
СП-32 gP120 502-516 e n v 62/156 (39,7%)
и - з gpl 20 505-516 e n v 13/71 (18,3%)
СП-29 gp41 593-604 e n v 17/55 (30,8%)
W gp41 584-604 e n и 144/202 (71,3%)
Z-3 gp41 598-609 e n v 7 1/75 (94,7%)
СП-5 gp41 598-609 e n v 179/223 (80,3%)
С П -7 gp41 600-618 e n v 293/313 (93,3%)
С П 6 gp41 600-618 e n v 110/217 (50,7%)
СП-15 gp41 601-616 e n v 249/263 (94.7%)
СП-23 g p 4 1 600-618 e n v 190/216 (88,0%)
СП-25 gp41 600-618 e n v 120/187 (64,2%)
СП-63 p27 13-28 n e f 14/143 (9,8%)
С.П-73 p27 54-69 n e f 8/86 (9,3%)
СП-58 p27 72-83 n e f 7/146 (4,8%)
СП-54 p27 143-159 n e f 25/148 (16.9%)
СП-52 p27 187-203 n e f 22/150 (14,7%)
* Н ум е р а ц и я ам и н о к и с л о т со о т в е т с т в у е т ш т ам м у BRU [19]. з а и склю ч ен и ем п еп ти д о в Z-3
(Z-3 [20]) и СП-28 (E L I [21]).
** В ч и с л и т е л е — чи сл о п о л ож и т е л ь ны х р е зу л ь т а т о в , в зн ам ен а т е л е — общее чи сло сы во роток.
являются важными прогностическими маркерами [11]. Семь пептидов
было выбрано из белков рбб, р51 и рЗ 1 (рисунок, б) — продуктов гена pol,
антитела к которым обнаруживаются в 75—80% случаев в сыворотке инфицированных
ВИЧ [12]. Из оболочечных гликопротеинов ВИЧ-j и
ВИЧ-2 (гены env) было выбрано 13 и 8 пептидов соответственно (рисунок,
в, д), причем большая часть из них приходится на трансмембранйые
белки gp41 и gp40, где, согласно литературным данным, находятся высо-
коиммунодоминантные районы [2, 13, 14].
Ряд авторов утверждают, что антитела к белку, кодируемому геном
nef, появляются до сероконверсии антител к основным структурным белкам
и, таким образом, обнаружение в крови антител к этому белку позволяет
проводить раннюю диагностику при заражении ВИЧ [15, 16].
Напротив, в некоторых работах указанное утверждение ставится под сомнение
[17, 18]. Для выяснения этого вопроса мы синтезировали 5 пептидов
из этого белка (рисунок, г).
В представленный набор входят 8 пептидов (СП-71 [23], СП-32 [24],
СП-29 [25], W [ l ] , Z-3 [25], СП-5 [25], СП-7 [26], СП-30 [25]), уже
2 В я о о р г а н и ч е с к а я х им и я , № 8 785
а)
СП-65 IRLRPGGKKKYKLKHIV
б)
СП-45* WKPKXIGGIGGFIK
СП-69 LETSEGC ( А с ni > RQILGQLQPS СП-50 PVFAIKKKDSTKWR
СП-71 MKSKKKAQQAAADTGM СП-48* GSPAIFQSS&TKILEPFRK
СП-38* APGQ—XR EPRGSDIA«GTTST СП-42 GLTTPDKKHQKEPPF
СП-37 DIRQGPKEPFRDYVDR СП-46 YWQATWIPEWEFVNTPP
и-г* BQGVGGPGHKARVL СП-61 EWEFVNTPPLVKLWYQL
СП-40* PGHKARVLAEAXSQVTNS СП-67 IQAQPDKSESELVMQIIE
И-2
В)
LTSLRSLFGKDPSSQ
г)
СП-26* XKVVKIEPLGVAPTKAKRRVVQREKRA СП-63* WPTVRER&RRAEPAAD
СП-18* &GVAPTKAKRRVVQREKRA СП-73 AC(Acm)AWLEAQEEEEVGFP
СП-32* ÇGÇAPTKAKRRVVQREKR СП-58* PQVPLRP^TYKA
И-3 KAKLRRVVQREKR СП-54 YKLVPVEPDKVEEANKG
СП-29 LGIWGCSGKHIC СП-52 SRLAFHHVARELHPEYG
W RILAVERYLKDQQLLGIWGCS
Z-3 LGLWGCSGKLIC Я)
СП-5 LGIWGCSGKLIC СП-11 EVKETLAKHPRYRG
СП-6* IWGSSGKLISTTAVPWNAS ’. СП-10 ELGDYKLVGITPIGFAPTKEKR
СП-7 IWGCSGKLICTTAVPWNAS СП-59* LQDQA-LNSWGCAFRQVCHT
СП-15 WGCSGKLICTTAVPWN СП-8 LNSWGCAFRQVCHT
СП-23* FGCSGKLICTTAVPp СП-20* LMSWGCAFRQVCHT-амид
СП-25* FGCSZKLICTTAVPEM СП-30
СП-9
СП-12*
LNSWCCAFRQVC
SWGCAFRQVCHTTVPWVND
SWGS.AFRQVSHTTVPWVMD
Синтетические пептиды иа белков, кодируемых генами gag (a), poi (б), епи (в), nef
(г) ВИЧ-1 и env ВИЧ-2 (<?). Звездочкой отмечены пептиды - аналоги природной
структуры. Замененные или добавленные аминокислотные остатки подчеркнуты
о п у б л и к о в а н н ы х к началу н а ш е й работы. Нас. интересовали антигенные
свойства пе ре численных пептидов на использованных в работе па нелях
ВИЧ-1 и ВИЧ-2-положительных сывороток. Кроме того, в ходе работы появлялись
публикации, в которых описывались пептиды, перекрывающиеся
с выбранными нами (СП-65 [2], СП-38 [23], СП-15 [23], СП-54
[15], СП-63 [15], СП-73 [15], СП-58 [15], СП-54 [151, СП-52 (15),
СП-59 [27]).
С целью упрощения синтеза в ряде пептидов (СП-38, СП-40, СГ1-45,
СП-48, СП-63, СП-58) имеющиеся в белке остатки метионина были заменены
изостерическими остатками норлейципа, при этом мы учитывали,
что такая замена обычно не приводит к снижению биологической активности.
По таким же сообраяшниям была произведена замена 1Ч-концевого
остатка цистеина на остаток а-аминомасляной кислоты в пептиде И-1.
Пептиды СП-26 и СП-18 были синтезированы длиннее природных фрагментов
на один М-концевой остаток норлейцина, а пептид СП-32 был
удлинен в N-концевой части на последовательность ССО. Эти изменения,
780
Таб лица 2
Реактивность синтетических пептидов в Т Ф И Ф А на панели сывороток,
содержащих антитела к ВИЧ-2
Пептид Белок * Участок последовательности
** Результат ТФИФА **л
С П -11 gpl20 352-365 14/24 (58,3%)
СП-10 gpl20 480-501 8/20 (40,0%)
СП-59 gp40 587-605 12/12 (100%)
СП-30 gp40 592-603 7/7 (100%)
СП-8 gp40 592-605 24/35 (68.6%)
СП-20 gp40 592-605 26/35 (74,3%)
СП-9 gp40 594-612 13/20 (65,0%)
СП-12 gp40 594-612 32/35 (91,4%)
* Б е л к и гена env.
** Н ум е р а ц и я ам и н о к и с л о т с о о т в е т с т в у е т ш т ам м у ROD (22).
*** См, п р им е ч ан и е к т абл. J.
практически не влияющие на антигенные свойства пептидов, были произведены
для получения конъюгатов с белками (данные не приведены).
Пептиды были синтезированы твердофазным методом. Деблокирование
и удаление пептидов со смолы проводили жидким фтористым водородом,
очистку осуществляли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Синтезированные
пептиды охарактеризованы аминокислотным анализом, FAB-
масс-спектрометрией и аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Для оценки реактивности пептидов — способности взаимодействовать с
сыворотками, содержащими антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, и сыворотками
здоровых доноров — использовали непрямой твердофазный иммунофер-
ментный анализ с пептидами в качестве антигенов.
Как видно из табл. 1, пептиды из белков, кодируемых геном gag, не
обладают сколько-нибудь заметной реактивностью. Наибольшей реактивностью
обладали фрагмент N-концевой части р17 СП-65 и фрагмент С-кон-
цевой части р24 СП-40. Пептид СП-65, полностью перекрывающий описанный
ранее пептид 22—29 [2], обладает почти в 2 раза большей реактивностью,
но все-таки недостаточной для использования его в качестве
антигена в ТФИФА. Пептид СП-38 (224—242), как и пептид 228—235
[2], который он в себя включает, не характеризуется высокой реактивностью.
Наоборот, по данным авторов, использовавших для тестирования
пептиды, связанные со смолой, пептид 226 — 237, входящий в состав СП-38,
и пептид 109 — 123, аналогичный СП-71, выявляют соответственно 15 и 10
сывороток из 15 ВИЧ-положительных [23], что значительно выше результатов,
полученных нами. Очевидно, предложенный авторами работы
[23] метод позволяет добиться большей чувствительности анализа.
Фрагменты продуктов гена pol характеризуются большей реактивностью,
причем более высокими антигенными свойствами обладают пептиды
из обратной транскриптазы р66/р51, а основной эпитоп находится в ее
С-концевой области (СП-46). Тот же вывод был сделан с помощью моноклональных
антител [28]. Пептиды СП-48, СП-42 и СП-67, входящие в
состав трех В-эпитопов обратной транскриптазы [29], определенных с помощью
рекомбинантных полипептидов, по нашим данным, не обладают
высокой реактивностью.
Как и следовало ожидать, пептиды из последовательностей белков, кодируемых
геном env, выделяются среди всех остальных пептидов высокой
реактивностью (табл. 1 и 2). Ранее мы уже сообщали об исследовании
антигенной области С-концевой части оболочечного гликопротеина gp!20
ВИЧ-1 [30]. Следует заметить, что у пептидов, представляющих данный
2* 787
антигенный район (СП-26, СП-18, СП-32, И-3), реактивность увеличивается
с удлинением пептида к N-концевой части гликопротеина (ср. И-3
и СП-26). Можно предположить, что самый длинный пептид СП-26 перекрывает
по крайней мере два В-эпитопа. Наши данные о реактивности
пептида СП-32 согласуются с литературными [24]. Реактивность пептида
И-3 (505—516) оказалась в 2 раза ниже реактивности рекомбинантного
химерного комплекса, состоящего из пептида 505—519 и ^-галактозидазы
[31]. Было показано [32], что пептид, идентичный И-3, реагирует с 19 из
20 ВИЧ-1-положительных сывороток. Пептид 495—516 [27], являющийся
укороченным аналогом СП-26, реагирует с 48 из 50 ВИЧ-1-положитель-
ных сывороток. По нашим данным, полученным на значительно большей
панели ВИЧ-1-положительных сывороток, реактивность пептидов И-3 и
СП-26 существенно ниже. M o h íh o сделать вывод, что для объективной,
статистически достоверной оценки реактивности пептидов необходимо использовать
достаточно большую панель сывороток.
Существенно выше реактивность пептидов из иммунодоминантного
района трансмембранного белка gp41. Наибольшее число ВИЧ-1-положи-
тельных сывороток (94,7%) выявляет пептид СП-15 (601 —616), хотя
пептид 600—616 [26], который длиннее всего на один аминокислотный
остаток, выявлял 7 из 10 (70%) ВИЧ-1-положительных сывороток. Пептид
СП-7 (600—618), включающий в себя СП-15, не проявлял 100% реактивности
в отличие от идентичного пептида 600—618 [26]. Синтезированные
нами с целью оптимизации структуры аналоги пептида СП-15 (СП-6,
СП-23, СП-25) не отличались высокой реактивностью [33]. Реактивность
пептида W (584—604) не была столь высокой, как сообщалось ранее [1].
Результаты, полученные нами, скорее согласуются с результатами более
поздних исследований [34]. Из пептидов Z-3, СП-5 и СГ1-29, представляющих
один и тот же фрапиент белка gp41, но из разных штаммов
ВИЧ-1 [25], только Z-3 обладал реактивностью, близкой к описанной,—
результаты тестирования СП-5 и СП-29 были ниже. Но все же реактивность
пептида СП-5 была почти в 2 раза выше, чем описано в литературе
[26, 34]. Причиной этого разногласия, вероятно, может быть различная
штамм-специфичность панелей ВИЧ-1-положительных сывороток.
Ни один иэ синтезированных фрагментов белка р27, кодируемого ге*
ном nef, не обладал высокой реактивностью. Наши результаты свидетельствуют
в пользу того, что В-эпитопы этого белка находятся ближе к его
С-концевой части, что согласуется с данными работы [18]. Пептид СГ1-54
(143—159), имеющий наибольшую реактивность, перекрывается с имму-
нодоминантиым пептидом 148—161 [15]. С другой стороны, имеются данные,
что в этой области белка В-эпитопа нет [16]. Выбранные нами для
синтеза пептиды из белка р27 частично перекрываются с ранее опубликованными
пептидами [15]. Такое совпадение не является неожиданным,
поскольку для предсказания В-эпитопов в обоих случаях использовались
сходные методы. Хотя реактивность описанных в работе [ 15] пептидов и
выше (30—60%), чем у пептидов, приведенных в табл. 1 (5—17%), данные
эти были получены на существенно меньшей панели ВИЧ-1-положи-
тельных сывороток.
Как видно из табл. 2, основной иммунодоминантный район env-белков
ВИЧ-2, расположен по аналогии с ВИЧ-1 в N-концевой части трансмембранного
белка gp40. 100-процентный результат, полученный с пептидом
СП-30, полностью совпадает с данными, приведенными для аналогичного
пептида [25]. При тестировании на большей панели ВИЧ-2-положитель-
ных сывороток пептида СП-8, который длиннее СП-30 на два аминокислотных
остатка, наблюдалось снижение реактивности. Замена в пептиде
СП-8 С-концевого карбоксила на карбамоильную группу (СП-20) привела
к некоторому увеличению реактивности. Пептид СП-59 (587—605) обла-
788
Результаты тестирования синтетических пептидов в ТФИФА иа панелях сероконверсин
Таблица 3
Образцы Д а т а в з я С
и н т е ти ч е с ки е п еп ти ды Те с т -си с т ем ы *
сывороток т и я крови
СП-40 ' СП-50 СП-46 СП-26 СП-15 СП-54 СП-52 А Б В Г д Е Ж
Панель «А»
BBI-01 04-05-81 - - - - - - - - - - - _ .. .
BBI-02 08-07-81 ~ - - ~ - - - - - - - _ - -
В Б 1-03 29-07-81 - ~ - - - - - - - „ - - - 4
BBI-04 19-08-81 - ~ - - + - - 4- + + + 4 4
BBI-05 02-09-81 - - - + + - - 4 + + + 4 4
BB1-06 09-09-81 - - - + + - - + 4- + + + 4 4
BB1-07 16-09-81 - - - + -г - ■Т- + + + 4 4 4
BBI-08 23-09-81 - - - + + - - + + + + + 4 д.
BBI-09 14-10-81 - - + + + - - + + + + 4 + 4
Панель «D»
BB1-40 29-04-81 - - - - - - - - - - - - -
B B 1-41 20-05-81 - - - - - _ - - ~ — - - - -
BBI-42 17-06-81 - - - - - „ ~ - - — - - - -
BBI-43 30-07-81 » - - 4 - - - + "Г + + i - + А
BBI-44 06-08-81 _ _ - + + 4 X- + 4 4 4
* Д ан ные в з я ты из с ер тиф и к а т а п ан елей с ер о к о н в ер си и «А» и «D»: А — A b b o t L a b o ra to r ie s ; В —* C e llu la r P ro d u c ts ; В — D u P o n t C om pany; Г — E le c tro -N u c le o -
n ie s ln c .; Д — G en etic Sy s tem s Corp.: E - ~ O rth o D ia g n o s tic S y s tem s In c .; Ж — O rg a n o n T e k n ik a Corp.
дал высокой реактивностью, как и перекрывающийся с ним ранее опубликованный
нептид 581—603 [27]. По техническим причинам в процессе
синтеза пептида СП-59 произошла делеция аргинина в положении 592,
но, как видно из табл. 2, отсутствие остатка аргинина не повлияло на
реактивность этого пептида. Интересно отметить, что пептид СП-12 является
аналогом пептида СП-9, у которого два цистеиновых остатка заменены
на сериновые, что исключает образование дисульфидной связи. Данная
замена неожиданно привела к увеличению реактивности пептида
СП-12, хотя в результате аналогичной замены (СП-6) в гомологичном
пептиде СП-7 из того же белка ВИЧ-1 мы получили падение реактивности
почти в 2 раза. Очевидно, в нативном белке между этими
остатками цистеинов не образуется дисульфидная связь. Мы не синтезировали
пептиды из других белков ВИЧ-2 из-за малой панели ВИЧ-2-по-
ложительных сывороток, которая не позволила бы получить статистически
достоверные результаты.
Для оценки возможности ранней диагностики антител к ВИЧ с помощью
синтетических пептидов мы протестировали в ТФИФА пептиды,
обнаружившие лучшие антигенные свойства, на панели сероконверсии
(табл. 3). Хорошие результаты показали только фрагменты оболочечных
гликопротеинов СП-26 и СП-15. Что касается пе/-пептидов, то эффективность
их использования для ранней диагностики, по нашим данным, сомнительна.
Следует добавить, что все пептиды также тестировались на панели сывороток
здоровых доноров, при этом не наблюдалось неспецифического
связывания.
Исходя из полученных результатов нами была подобрана композиция
из трех пептидов и на ее основе разработана диагностическая тест-система
для обнаружения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Экспериментальная часть
В работе использовали производные аминокислот и реактивы фирм
Reanal (Венгрия), PRF (Япония), Fluka (Швейцария). В качестве носителя
использовали смолу BIO-BEADS S-Xl (Bio-Rad, США). Отщепление
со смолы и деблокирование пептидов проводили в аппарате фирмы
PRF (Япония). В работе использованы образцы сывороток крови, содержащих
антитела к ВИЧ-1, ВИЧ-2, а также сыворотки здоровых доноров
из коллекции СНИЛЭГ1 СПИД ЦНИИ эпидемиологии М3 СССР, панели
сероконверсии Boston Biomedica (США).
ВЭЖХ пептидов осуществляли на хроматографе фирмы Gilson
(Франция). Для препаративной ВЭЖХ использовали колонки Ultrasphere
Octyl (10X250 мм, 5 мкм; Altex) и Vydac С18 (10X250 мм, 10 мкм;
Vydac), для аналитической ВЭЖХ — колонку Ultrasphere Octyl (4,6Х
Х250 мм, 5 мкм; Altex).
Растворители абсолютировали по методикам [35]. Аминокислотный
анализ проводили после кислотного гидролиза (смесь концентрированная
НС1 — пропионовая кислота, 1:1, с добавлением 0,5% фенола, 24 ч в запаянных
ампулах при 110°С) на анализаторе Durrum Marek (США).
Масс-спектры регистрировали на приборе MS 50 ТС (Kratos, Англия)
в режиме бомбардировки ускоренными атомами ксенона (FAB).
Для твердофазного синтеза пептидов использовали модернизированный
нами синтезатор Beckman 990 (США) [36]. Смолу аминометилировали
по методике [37]. Концентрация аминогрупп составляла 0,25—0,5 ммоль/г
«молы. Якорные группировки вводили при помощи «-гидроксиметилфе-
нилацетамидОметильного производного защищенной С-концевой аминокислоты
[37].
Для временной защиты а-аминогруип использовали Вос-группу.
В качестве защит боковых функций аминокислот использовали: для Asp,
Glu — бензиловый и циклогексиловый эфиры; для Arg — тозильную группу;
для His — бензилоксиметильную и 2,4-динитрофенильную группы; для
Ser, Thr — бензильную группу; для Туг — 2,6-дихлорбензильную группы;
для Lys — 2-хлорбензилоксикарбонильную группу; для Cys — ацетамидо-.
метальную и 4-метилбензильную группы. Аминокислоты конденсировала
с помощью симметричных ангидридов и оксибензотриазоловых эфиров в
DMF.
Полноту протекания реакции контролировали с помощью нингидрино
вого теста [38]. Для удаления Вос-группы использовали смесь TFA
СНС13 (1:1) с последующей нейтрализацией 7% раствором диизопропил
этиламина в DMF.
Подробная методика твердофазного синтеза пептидов представлена 0
работе [36]. Деблокирование пептидов и снятие их со смолы осуществляли
по стандартным методикам [39].
Твердофазный имму но ферментный анализ. В лунки планшета для микротитрования
Maxisorb (Nunc, Дания) вносили по 100 мкл раствора испытуемого
пептида в концентрации 1 мкг/мл в 0,1 М NaHC03. После инкубации
в течение ночи при 4° С планшеты промывали 4 раза 0,01 М фосфатным
буфером, pH 7,0—7,2, содержащим 0,05 % твин-20 и 4% NaCl. Все
последующие промывки осуществляли этим же буфером. По 100 мкл сывороток
крови, разведенных 0,1 М фосфатным буфером, pH 7,0, содержащим
0,2% твин-20 и 4% NaCl, в соотношении 1 :50, вносили в лунки
планшетов и инкубировали 30 мин при 37° С. Планшеты промывали
4 раза и в лунки вносили по 100 мкл конъюгата белка А золотистого стафилококка
с пероксидазой хрена (Amersham, Англия) в рабочем разведении
и выдерживали 30 мин при 37° С. После очередных промывок я
лунки добавляли 100 мкл раствора о-фенилендиамина (0,5 мг/мл) в
0,05 М цитрат-фосфатном буфере, содержащем 0,006% Н20 2. Чере?
15 мин реакцию останавливали 1 М H2S04 и результат учитывали на фотометрическом
детекторе MR-700 (Dynatech, ФРГ) при 492 нм. Для оценки
результатов реакции в лунках с сыворотками вычисляли пороговое
значение ПА,,,Г> по формуле ПЛ 492=Х+3-а, где К — среднее арифметическое
значение поглощения не менее трех отрицательных сывороток, а --
среднеквадратичное отклонение. Результат теста считался положительным,
если для исследуемого образца полученное значение оптического
поглощения было больше или равно ИА,М1 и отрицательным, если меньше
П^4 492 *
С П И С О К Л И Т Е Р А Т У Р Ы
1. Wang J. 3. G., Steel S., Wisn.iewolski R., Wang C. Y. II Proc. Nat. Acad. Sei. USA.
1986. V . 83. № 16. P. 6159-6163.
2. Gnann /■ H\, Schwimmbeck P. L., Nelson J. A., Truax A. B., Old-stone M. B. A. H l ,
Infect, Dis. 1987. V. 156. № 2. P. 261-267.
3. Smith R. S., Naso R. B., Rosen Whalley A., Horn Y.-L., Носу K., Kennedy C. 1,
Mc-Cutchan 1. A., Spector S. A., Richman D. D.j l J. Clin. Microbiol. 1987. V. 25. № 8 ,
P. 1498-1504.
4. Петров P. S., Хаитов P. M., Фоника Л. A., Лиознер А.Л. , Андреев C. M., Азъму
ко A. A.. Трубченинова Л. П., Вафина M. Г., Иващенко М. E., Костромича М. И.Ц
Иммунология. 1986. Т. 5. С. 80-81.
5. Khalife Guy В., С apron М., Kieny М.-Р., Amei sen J.-C., Montagnier L. , Lecocq J.-P.,
Сapron A. //AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1988. V, 4. № 1, P. 3-9.
6. Hopp T. P., Woods К. H Proc, Nat, Acad. Sei. USA. 1981. V. 78. № 6. P. 3824-3828,
7. Welling G. W., Weijer W. J., van der Zee R., Welling-Wester S. // FEBS Lett, 1985,
V. 188. № 2. P. 215-218.
8. Karplus P. A., Schulz G. E. // Naturwissenschaften. 1985. В. 72. № 4. S. 212-213,
9. Gami er J., Osgu.th.ope O. J., Robson B. Jf J. Mol. Biol. 1978. V. 120. Jü i, P. 97— 120.
10. Myers G., Rabson A. В., Josephs S. F., Smi t h T. F., Wong-Staal F . / / H u m a n Retroviruses
and AIDS 1988: a Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino
Acid Sequences. Los Alamos: Los Alamos National Laboratory, 1988. P. 11-68-11-91.
:il. Ragni M. V., O'Brien T. A., Reed D., Spero J.A., Lewis I. Н. Ц AIDS Res. Hum. Retroviruses.
1988. V. 4. P. 223-231.
22. üeVico A. L., Veronese F. M., Lee S. L., Gallo R. C., Sarngadharan M. G.ll AIDS
Res. Hum. Retroviruses. 1988. V. 4. № 1. P. 17-22.
13. Norrby E., Biberfe'ld G., Chiodi F., Gegerjeld <4., Naucler A., Parks E., Lerner R. j j
Nature. 1987. V. 329. P. 248-250.
14. Närväneti A., Korkolainen M., Kontio S., Suni Turtianen S., Partanen P., Soos
Vaheri A., Hahtala M.-L. If AIDS. 1988. V. 2. P. 119-123.
15. Amei sen J.-C., Guy B., Chamaret S., Loche M., Mouton Y., Neyrinck J.-L., Khalije
Leprevost C., Beaucaire G., Boutillon C., Gras-Masse H., Maniez M., Kieny M.-P.,
Laustriat Ü., Berthier A., Mach B., Montagnier L., Lecocq ¡.-P., Capron A. I / AIDS
Res. Hum. Retroviruses. 1989. V. 5. № 3. P. 279-291.
16. Gomberi F. O., Blecha VV., Tahtinen M., Ranki A., Pfeifer S., Troger W., Braun R.,
Muller-Lantzsch N.. Jung G., Rabsamen-Waigmann H., Krohn K. II Virology. 1990.
V. 176. P. 458-466.
17. De Bonde A., Reiss P., Dekker J., De Wol f F., Van Den Hoek A., Wolfs Т., Debouch
C., Goudsmit /.//Lancet. 1988. V. ii. P. 574.
18. Sabatier J.-M,, Clerget-Raslain B., Fontan G., Fenouillet E., Rochal H., Granier C.,
Glackman J.-C., Van Rietschoten Montagnier L., Bahraoui E. //AIDS. 1989. V. 3.
P. 215— 220.
19. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. II Cell. 1985. V. 40. P. 9-17.
20. Willey R. L., Rutledge R. A., Dias S., Folks Т., Theodore Т., Buckler C., Martin M. A. II
Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1986. V. 83. P. 5038-5042.
21. Alizon M., Wain-Hobson S., Montagnier L., Sonigo P. // Cell. 1986. V. 46. P. 63— 74,
22. Guyader M., Emerman M., Sonigo M., Clavel F., Montagnier L., Alizon M. Ц Nature.
1987. V. 326. P. 862-669.
23. Modrow S., Hoflacher S., Mertz R., Wolf H. / IL Immunol. Methods. 1989, V. US,
№ 1. P. 1-7.
24. Palker T. )., Matthews T. J., Clark M. E., Cianciolo G. J., Randall R. R., Langlois A.J.,
White G. C., Safai B.: Snyderman R., Bolognesi D., Haynes В. F. Ц Proc. Nat. Acad.
■Sei. USA. 1987. V. 84. P. 2479-2483.
25. Gnann J. W., McCormick J. B., Mitchell S., Nelson J., Oldstone M. В. А.Ц Science.
1987. V. 237. P. 1346-1348.
26. Rosen J. Horn Y., Whalley A. S., Smi th R. S., Naso R. B. //HIV Detection by Genetic
Engineering Methods/Eds Luciw P. A., Steimer K. S. N e w York, Basel: Marcel
Dekker, Inc., 1989. P. 143-160.
27. Хаитов P. M., Сидорович И. Г., Павликов С. П., Николаева И. А., Иващенко М. Е-,
Андреев С. М., Скляров Л. Ю. II Иммунология. 1990. Т. 2. С. 15-20.
28. Chandra Р., Gerber Т., Chandra .4., Sarin P. S., Pavli kov S. P., Sidorovich /., Khaitov
R., Ivanov V., Koziach ^.//Biomed. Sei. 1990. V. 1. № 5. P. 507— 5>12.
29. Padberg C., Nowlan S., Mermer В.Ц AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1989. V. 5. № 5.
P. 61-71.
30. Иванов В. С., Чикан Л. Д., Кожич А. Т., Павлиров С. П., Иващенко М. Е.Ц 5-я Конференция
молодых ученых социалистических стран по биоорганической химии.
Тезисы докладов. Пущино, 1988. С. 41-42.
31. *Skafferman A., Lennox /., Grosfeld H., Sadoff J., Redfi eld R. R., Burke D. S. II AIDS
Res. Hum. Retroviruses. 1989. V. 5. № 1. P. 33-39.
32. Лиознер A. Л., Цыганков A. Ю., Мещерякова Д. В., А угеншлюс А. И., Кауров О. /S.,
Прусаков А. Я., Афонин В. Г., Скляров Л. Ю., Николаев А. Ю.Ц Иммунология.
1990. Т. 3. С. 10-12.
33. Ivanov V. S., Suvorova Z. K., Tchikin L. D., Kozhich A. T. // 4th Meeting on Bioorganic
Chemistry of Peptides. Abstracts. Czechoslovakia. 1989. P. 35.
34. Döpel S.-H., Porstmann Т., Henklein Р., von Baehr R. // ,T. Virol. Methods. 1Э89. V. 25.
P. 167-178.
35. Perrin D D., Armarego W. L. F., Perrin D. R. II Purification of Laboratory Chemicals.
Pergamon Press, 1985. P. 167-168, 224, 445— 446, 448.
36. Чикин Л. Д., Кожич А. Т., Иванов В. С., Иванов В. Т., Насташенко Т. A., h у-
сов Ю. Ю., Балаян М. С. // Биоорган. химия. 1991. Т. 17. № 7. С. 964-972.
37. Mitchell A. R., Kent S. В. H., Engelhard M., Merrifield R. S.//J. Org. Chem. 1978,
V. 43. № 13. P. 2845-2852.
38. Sarin V. K., Kent S. B. H., Engelhard M., Merrifield R. В. II Anal. Biochem. 1981.
V. 117. № 1. P. 147-157.
39. Stewart J. M., Young J. D. II Solid Phase Peptide Synthesis. Rockford, Illinois: Pierce
Chemical Comp., 1984. P. 85-89.
Поступила в редакцию
17.XII.1991
792
V . s . I V A N O V , L. D . T C H I K I N , Z . K. S U V O R O V A » , A T. K O Z H I C H ,
V . T . I V A N O V
S T U D Y O F T H E A N T I G E N I C S T R U C T U R E O F H U M A N I M M U N O D E F I C I E N C Y
V I R U S E S B Y M E A N S O F S Y N T H E T I C P E P T I D E S
M . M. Shemyakin Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences,
Moscow;
*Central Institute of Epidemiology, Moscow
In a search for synthetic peptide antigens fit to detect anti-HIV antibodies, a set
of algorithms were used to predict the probable antigenic determinants of gag, pol, env
and nef proteins of HIV-1 and HIV-2. Over forty peptides were synthesised by the s<3-
lid-phase method. The reactivity of the peptide antigens was evaluated in EL I S A on panels
of HIV-l/2-positive sera. Application of the synthetic peptides for the early H I V
diagnostics was examined.
793

Комментировать